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本实验室在前期研究中,证明了苯并噻二唑(benzothiadiazole,BTH)能诱导水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等病害的系统抗病性,并在此基础上运用抑制性差减杂交法分离鉴定了200多个与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA。同源性搜索发现,其中一个差异表达片段BIHI-n2与已知植物EREBP型转录因子具有相似性。为探讨这个可能的ERF基因的生物学功能以及在水稻抗病性中的作用,本研究通过5’RACE和3’RACE,克隆得到了这个基因的全长cDNA序列,命名为OsBIERF1。此外运用生物信息学的方法,在水稻中得到另外三个ERF基因的全长cDNA序列,命名为OsBIERF2～4。 在这些与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA中,克隆BIHI-n2含有567 bp的插入片段,根据其序列设计基因特异性引物,分别与载体通用引物配对,从水稻cDNA文库中通过PCR扩增到基因的5’端和3’端序列,测序并拼接得到全长为1613bp的cDNA序列OsBIERF1,其中包含一个1200bp的(ORF)。该基因编码一个含399氨基酸的蛋白,并含有一个保守的ERF结构域。OsBIERF2～4这三个基因的克隆则运用了生物信息学及电子克隆的方法。首先在水稻基因组数据库中搜索与OsBIERF1 cDNA相似的序列,得到了一些可能的ERF基因序列片段。将这些预测的ERF cDNA序列片段在水稻ESTs库中进行搜索,然后将搜索得到的片段进行组装,得到完整的ERF基因序列。再设计特异性引物,也以水稻cDNA文库为模板,PCR扩增到OsBIERF2～4的全长cDNA序列。其大小分别为1116bp、1199bp和1214bp,并各自包含大小为708bp、912bp和987bp的开放阅读框,分别编码235、303和328氨基酸的蛋白。证明其编码的蛋白序列也都包含保守的ERF结构域。进一步分析发现,这四个基因都以单拷贝形式分别存在于水稻第9,1,2和3号染色体上。序列比对及系统树分析发现,OsBIERF1-4属于ERF蛋白家族中不同的亚组。OsBIERF3属于第Ⅰ亚组,OsBIERF2属于第Ⅱ亚组,OsBIERF1和OsBIERF4则被归为第Ⅳ亚组。将OsBIERF3的编码区ORF克隆进原核表达载体,纯化获得重组的OsBIERF3融合蛋白。凝胶阻滞实验的结果表明,重组OsBIERF3融合蛋白能够