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玉米是世界范围内种植范围最广,产量最高的粮食作物,为保证我国及世界粮食安全做出了重要贡献,同时玉米还是饲料和工业加工的重要原料。在世界人口不断增加,农业资源不断减少,而气候环境条件不断加剧的多重压力下,开发用于玉米遗传改良的新技术,对于揭示玉米重要农艺性状的作用机理及性状的遗传改良具有重要意义。基因打靶技术,在基因组原位实现对基因的精确、定点、可遗传修饰,是玉米遗传改良和分子设计的理想途径。作为一门新兴的第三代人工核酸酶技术,由RNA介导的CRISPR-Cas9系统以其系统构建简单、精准度高、成本低、能同时对多个位点进行定点编辑的各项优势,成为目前研究的热点。本研究探索了利用CRISPR-Cas9对玉米基因组实施定点突变的技术体系,搭建了玉米基因组高效定点突变的技术平台,主要结果如下：1.优化了酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) CRISPR-Cas9系统的核心组分。根据玉米基因组密码子的使用特点,对Cas9基因的密码子进行了优化,在ZmUbi启动子的驱动下,通过玉米原生质体瞬时转化,成功检测到优化后Cas9蛋白的表达及核定位。同时在玉米基因组中对驱动sgRNA转录的Pol Ⅲ RNA聚合酶类启动子进行挖掘,成功筛选出有功能的玉米U6 snRNA基因启动子ZmU6-1,并在玉米的原生质体中检测到sgRNA的转录。2. 根据sgRNA识别的靶向位点的序列特征,在玉米全基因组范围内筛选出高度特异的sgRNA靶标序列,建立了全基因组范围CRISPR-Cas9介导玉米基因组定点编辑的靶点序列数据库。通过玉米原生质体瞬时转化的方法,在设计的76个内源位点处,成功检测到CRISPR-Cas9的作用活性,位点的剪切效率在0.18%-78.83%。同时确定Pol Ⅲ RNA聚合酶类启动子ZmU6-1的转录起始位点可以为除“G”以外的其他核苷酸,扩大了玉米基因组sgRNA靶标序列的选择范围。3. 以ZmPSY1基因作为示例对CRISPR-Cas9介导产生的遗传突变的类型、突变的可遗传性及遗传特点进行研究。研究表明CRISPR-Cas9介导产生的遗传变异主要以短片段碱基的插入和缺失为主,同时遗传变异可以稳定的遗传给下一代,并且只要细胞内存在CRISPR-Cas9就能继续对未进行修饰的靶向位点进行编辑。4. 对CRISPR-Cas9介导RGN1位点的识别特异性研究发现,CRISPR-Cas9对筛选的潜在脱靶位点没有产生非特异性剪切,位点识别特异性较好。同时,通过转录组数据分析发现,CRISPR-Cas9体系对RGNl突变材料的全基因组基因的表达水平没有产生影响。然而对玉米基因组其他位点定点编辑产生的突变体材料,却发现可能由Cas9蛋白引起脱靶事例。因此,建立综合的CRISPR-Cas9体系位点识别特异性的评估系统,尽量降低Cas9蛋白引起的位点脱靶,对于我们高效应用CRISPR-Cas9进行玉米基因组定点编辑十分必要。