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东方白鹳是分布于亚洲的大型涉禽，IUCN红色物种名录的濒危(EN)物种。近年来,由于自然栖息地面积骤减、种群数量下降、分布区片段化且日益萎缩,目前东方白鹳的全球野生种群数量仅3000只左右,且呈下降趋势,对该物种的保护刻不容缓。目前东方白鹳的遗传学研究进行得较少,尚不能搞清其遗传背景。 微卫星是一种高灵敏度的分子标记,由于在信息量、实验操作、分析方法等方面的明显优势,微卫星标记已经成为保护遗传学研究领域最有力的分子标记手段,但对于东方白鹳来讲,目前尚没有多态性的微卫星位点,无法应用微卫星分子标记来进行遗传学研究,因此本研究首先利用两种不同的方法筛选得到东方白鹳的微卫星位点,继而利用筛选出的微卫星位点对我国东方白鹳的遗传多样性进行分析,为东方白鹳保护策略的制定提供科学依据。 1.本研究利用交叉扩增法筛选东方白鹳的微卫星位点,采用近缘种黑头鹮鹳的11个微卫星位点做引物,经过对PCR体系的优化,在11个位点中有6个得到清晰的扩增条带,其余5个位点得不到确切的扩增产物。对上述6个位点的扩增产物进行克隆测序分析,发现其中4个位点上的扩增产物含有微卫星重复序列,而另外2个位点中无重复单元。 2.利用链霉亲和素与生物素之间有强亲和性的原理,首次采用FIASCO法直接筛选东方白鹳微卫星位点。经过酶切连接,探针杂交,磁珠富集,双链恢复,蓝白斑筛选,最后得到120个阳性克隆,其中55个含有微卫星序列重复序列。经过分析,21条为完美型重复,20条为不完全重复序列,14条为混合重复序列。此外,除二碱基和三碱基序列外,我们还得到了4条六碱基,1条七碱基,2条五碱基,1条四碱基的重复序列。 3.在55个位点中选取13个适合的位点设计引物,并将之与交叉扩增法获得的4对微卫星引物一起进行高效液相色谱分析,成功筛选出了能够应用于东方白鹳的保护遗传学研究的10个位点,这10个位点分别为C.bo133、C.bo151、C.bo102、C.bo108、C.bo109、C.bo121、C.bo168、C.bo235、Wsu13、Wsu17。