MeCP2基因及BDNF基因与儿童孤独症相关性的研究前言儿童孤独症（Autism）是以严重的社交障碍、语言交流障碍和狭窄、刻板的兴趣行为为特征，同时伴有不同程度的智力低下及显著的社会适应能力缺陷的广泛性发育障碍。孤独症的发病率为1‰～6‰，远非少见病例，而且近年来其发病率呈现上升的趋势。由于尚无有效的治疗方法，患者预后较差，严重者甚至终生需要他人的监护，给家庭和社会带来沉重的精神及经济负担。因此积极探索孤独症的发病机制，为其有效的预防及干预提供方向已成为当务之急，并引起了人们的高度关注。孤独症的病因目前尚不清楚，大量证据显示其发生具有显著的遗传背景。孤独症的男女发病率之比约为4～6:1，这种显著的性别差异提示孤独症的发病机制中可能涉及X连锁基因的作用，在已完成的基因组扫描连锁分析研究中，也有较多证据显示孤独症与X染色体存在相关。X连锁MeCP2基因位于染色体Xq28，主要在脑内表达，不仅与神经元发育有关，而且与突触的形成、分化有关，特异性地敲除大鼠脑内的Mecp2基因可导致严重的脑发育障碍。1999年MeCP2基因被确定为Rett综合征（Rett syndrome，RTT）的致病基因，而RTT和孤独症均属于广泛性发育障碍（PDD），二者具有许多相似的临床表现，其中发育倒退（语言、社交功能及智力倒退）是RTT患儿和部分孤独症患儿的共同表现。这种临床表型的相似性使人们推测孤独症与RTT可能具有某些共同的发病机，因此，MeCP2基因也成为孤独症的重要候选基因。MeCP2蛋白是甲基化结合蛋白家族中的主要成员，通过与甲基化DNA的特异性结合，抑制其下游靶基因的转录，起到转录调节的作用，因此是重要的转录抑制因子。当MeCP2基因功能异常时，则不能对相应的下游靶基因产生抑制作用，从而使基因的表达异常，导致疾病的发生。近年来的研究表明MeCP2基因的转录抑制作用具有特异性，仅作用于特异的靶基因。那么在MeCP2基因作用通路上不同环节（MeCP2基因自身或其下游靶基因）的异常可能会产生相似的临床表现，由此推测孤独症与RTT可能是由于MeCP2基因作用通路上的不同环节异常所致。因此，探讨MeCP2基因及其下游靶基因与孤独症的相关性可能有助于揭示孤独症的发病机制。作为重要的转录调控基因，MeCP2基因的作用靶基因也始终是人们关注的热点。2003年Martinowich通过研究证实MeCP2可以特异性地结合BDNF基因的启动子，抑制BDNF基因的转录；当使MeCP2与BDNF基因启动子的亲和力下降时，则BDNF基因的转录增加。此后陆续有研究证实MeCP2基因能够特异性地影响BDNF基因的表达和功能，因此确定BDNF基因是MeCP2基因的作用靶基因。BDNF基因（Brain-derived neurotrophic factor Gene，BDNF gene）位于染色体11p13，编码小分子二聚体蛋白—BDNF（神经生长因子），与神经元的生长、存活以及功能性突触的构建有关。目前已有许多研究报道BDNF基因与神经精神疾病有关，如精神分裂症、强迫症等，但有关BDNF与儿童孤独症关系的研究尚不多见。2001年Nelson报道孤独症患儿新生儿时期的血标本中神经生长因子BDNF水平显著高于对照组。这一研究结果此后被进一步证实，Perry（2001年），Miyazaki（2004年）和Connolly（2006年）分别报道孤独症患者脑内及血中BDNF水平高于对照组。这些研究表明孤独症患儿体内BDNF水平处于异常水平，这种变化是原发改变还是继发改变目前尚不清楚，但提示人们BDNF可能在孤独症的发生发展过程中起到一定作用。基于上述依据，本研究首先选择与RTT患儿有较多相似性的孤独症患儿（具有明确的发育倒退史）进行了MeCP2基因的突变分析，以探讨MeCP2基因在孤独症发病中的作用以及孤独症发育倒退表现的机制；同时我们选择了BDNF基因内的3个单核苷酸多态位点（SNPs）：rs6265、rs11030104和rs10835210，对其等位基因在辽宁地区汉族人群中的分布特点进行了研究，并在孤独症核心家系中进行了传递不平衡检验，旨在探讨BDNF基因与孤独症的相关性及其在孤独症发病中的作用。对象与方法1、对象孤独症核心家系112个（孤独症患儿及其父母）及100名健康体检者。患儿中男性103名，包括31名具有发育倒退史的患儿，女性9名，年龄2岁-12岁。所有患儿为正常足月出生，既往无神经系统疾病及其他躯体疾病史，除外染色体异常。采用儿童孤独症评定量表（Child Autism Rating Scale，CARS）对患儿进行评定，本组患儿的评分范围在32～41分之间，符合DSM-Ⅳ孤独症的诊断标准。所有研究对象均为汉族，患儿的父母系随机婚配，身体健康，各家系之间无血缘关系。2、方法留取所有受试者外周静脉血3-5ml，采用酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA。根据参考文献19设计MeCP2基因编码外显子引物；根据NCBI的SNP数据库选择BDNF基因内的SNPs位点，采用Primer Premier 5.0软件进行BDNF基因SNPs的引物设计，并进行酶切位点分析。引物由TakaRa生物公司合成，限制性内切酶购自TaKaRa生物公司及生工公司。常规PCR方法扩增目的片断，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。对MeCP2基因的突变检测采用DNA直接测序的方法：PCR产物纯化后采用荧光素末端标记法(BigDye^TM Terminator)，经AB1377型全自动测序仪进行DNA测序；BDNF基因的SNP等位基因分型采用限制性片段长度多态性（RFLP）的方法，PER扩增产物经限制性内切酶消化，酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶自动成像系统扫描，记录各样本SNP的等位基因型。3、统计学分析DNA测序结果在BioEdit软件中进行分析，并与人类基因组序列AF030876和X99686进行比对分析；根据Hardy-Weinberg平衡定律对各多态位点的基因型和等位基因频率进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验；采用在线分析程序SHEsis online program进行连锁不平衡检验；各SNP位点与孤独症的关联分析采用传递不平衡检验（Transmission Disequilibrium Test，TDT），数据处理采用SPSS 13.0软件包，以P＜0.05为有显著性差异的界限。结果对31例具有明确发育倒退史的孤独症患儿进行了MeCP2基因编码区、侧翼序列及部分3’端非翻译区（3’untranslated region，3’UTR）的突变分析，结果发现1例患儿在3’UTR区域存在DNA序列的碱基替换，序列变异为1461*139 A＞G；未发现编码区突变。BDNF基因内的3个SNP位点：rs6265，rs11030104和rs10835210在辽宁地区汉族人群中均有多态性，其等位基因及基因型频率分别为rs6265：AA 0.19，AG0.56，GG 0.25，A 47.0％，G 53.0％；rs11030104 AA 0.30，AG 0.49，GG 0.18，A 54.5％，G 45.5％；rs10835210：AA 0.11，AC 0.42，CC 0.47，A 32.0％，C 68.0％，符合Hardy-Weinberg平衡定律；各位点的等位基因频率在不同种族人群中存在较大差异。将BDNF基因的3个SNP位点：rs6265，rs11030104和rs10835210在孤独症核心家系中进行传递不平衡检验，结果显示rs11030104存在显著的传递不平衡，x²=6.722，P=0.010；多态位点rs10835210在有发育倒退史的孤独症核心家系显示明显的传递不平衡，x²=3.857，P=0.05，提示BDNF基因与孤独症存在相关，并可能与孤独症的发育倒退有关，因此，BDNF基因可能是孤独症的易感基因。结论1．MeCP2基因编码区突变不是孤独症的主要发病机制，MeCP2基因可能以不同的作用方式参与孤独症的发病。2．MeCP2基因3’UTR的突变是否会影响MeCP2基因的正常表达，增加孤独症的易感性，值得进一步探讨。3．BDNF基因的3个SNPs：rs6265、rs11030104和rs10835210在我国辽宁地区汉族人群中均有多态性，可以作为遗传标记用于相关疾病的关联分析及连锁分析。4．rs6265、rs11030104和rs10835210的等位基因频率在不同种族间存在显著差异。5．BDNF基因的单核苷酸多态位点rs11030104在孤独症家系中存在传递不平衡，提示BDNF基因与孤独症存在相关，可能是孤独症的易感基因。6．BDNF基因的单核苷酸多态位点rs10835210在有发育倒退表现的孤独症核心家系中显示传递不平衡，提示rs10835210可能与孤独症的发育倒退有关。