研究背景胰腺纤维化是慢性胰腺炎的病理特征，其本质是以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增多，而降解相对减少，两者失去动态平衡，致使过多的ECM沉积所致。近年来的研究发现氧化应激、胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSCs）及多种细胞因子与胰腺纤维化密切相关。越来越多的研究显示胰腺纤维化的发生发展与氧化应激、脂质过氧化等有关：氧化应激不仅能够直接导致胰腺细胞损伤，还能激活PSCs，加速纤维化进程。活化的PSCs是胰腺纤维化过程中胶原产生的重要来源。转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁，TGF-β₁）是最强的促纤维化细胞因子，能够激活PSCs，增加PSCs合成分泌ECM；抑制PSCs分泌金属基质蛋白酶，并刺激PSCs分泌蛋白酶抑制剂而减少ECM降解；上调PSCs表达TGF-β₁及其受体，产生自身放大效应；此外，TGF-β₁还能通过调节其他细胞因子的表达，促进纤维化形成。而结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）和TGF-β₁具有协同作用，是TGF-β₁发挥生物学效应的下游因子。血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）与PSCs的活化和增殖存在密切关系，并且PDGF具有明显的促有丝分裂以及刺激胶原和纤维连接蛋白合成作用。氧化应激、PSCs活化和细胞因子是胰腺纤维化的重要机制，三者之间存在交互作用。脂质过氧化作用刺激PSCs活化，同时氧自由基不断攻击胰腺细胞造成慢性损伤，久而久之形成纤维化；活化后的PSCs分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM和TGF-β₁等细胞因子促进纤维化；TGF-β₁等细胞因子一方面刺激ECM合成，另一方面通过自分泌或旁分泌的形式激活PSCs，加速纤维化形成。现代研究发现，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallte，EGCG）因其儿茶素B环和C环上的酚羟基具有提供质子的活性，能够清除自由基、抑制脂质过氧化、增强其他氧化剂的抗氧化能力，并且具有多种药理作用：抗肿瘤、降低血脂、抗炎和抗纤维化作用。因此推测EGCG对氧化应激所致的胰腺损伤及胰腺纤维化应有保护治疗作用。迄今为止对EGCG对胰腺纤维化的作用及其机制缺乏系统深入的研究，国内外尚无EGCG治疗实验性胰腺纤维化的研究报道。为此，我们利用二乙基二硫代氨基甲酸盐（diethyldithiocarbamate，DDC）诱导大鼠胰腺纤维化模型，采用EGCG对其进行治疗，分别从氧化应激、细胞水平和分子水平探讨EGCG对实验性大鼠胰腺纤维化的作用和机制。研究目的1．应用EGCG对胰腺纤维化大鼠进行治疗，观察各组大鼠胰腺组织病理学变化及EGCG对大鼠胰腺组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和铜锌-超氧化物歧化酶（copper／zinc superoxide dismutase，CuZn-SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-PX）活力的影响，探讨EGCG对大鼠胰腺组织氧化应激损伤的保护作用。2．通过观察大鼠胰腺组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达的变化及Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积的情况，研究EGCG对大鼠PSCs活化的影响，从细胞水平探讨EGCG抗大鼠胰腺纤维化的作用机制。3．通过观察EGCG对大鼠胰腺组织中TGF-β₁及其信号转导蛋白Smad3、Smad7表达的影响，从分子水平探讨EGCG抗大鼠胰腺纤维化的作用机制。研究方法1．动物分组40只雄性Wistar大鼠随机分为5组：模型组、低剂量EGCG组、中剂量EGCG组、高剂量EGCG组和对照组。除对照组外，各组大鼠均给予1ml／100g体重的DDC（用蒸馏水配制成75mg／ml的溶液）腹腔注射，每周两次，共10周。低、中、高剂量EGCG组大鼠在模型组的基础上2周后按1ml／100g体重的剂量给予浓度分别为5mg/ml、10mg/ml和20mg/ml的EGCG灌胃（EGCG均用0.5％羧甲基纤维素钠配成混悬液），每天一次，共8周。对照组给予1ml／100g体重的蒸馏水腹腔注射，每周两次，两周后并给予1ml／100g体重的0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，每天一次。实验10周末处死全部大鼠，留取胰腺组织，将其中一部分迅速保存在液氮罐里，然后转移至低温冰箱-80℃保存，用于组织匀浆蛋白测定及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测；将另外一部分胰腺组织用10％福尔马林溶液固定，用于病理组织学分析和免疫组织化学染色。2．胰腺组织切片H-E染色，在光镜下观察各组大鼠胰腺组织病理学改变。3．应用组织匀浆法及分光光度法测定大鼠胰腺组织中MDA含量和CuZn-SOD、GSH-PX活力。4．胰腺组织切片苦味酸天狼星红染色，在偏振光显微镜下观察大鼠胰腺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原沉积情况，利用计算机图象分析系统计算各组大鼠胰腺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量。5．应用免疫组织化学染色方法检测大鼠胰腺组织中α-SMA、TGF-β₁、Smad3、Smad7蛋白的表达，利用计算机图象分析系统进行定量分析。6．应用RT-PCR技术检测胰腺组织中CuZn-SOD、α-SMA、TGF-β₁、Smad3、Smad7 mRNA的表达，利用计算机图象分析系统计算各组目的基因表达的相对系数。7．统计学处理用SPSS12.0统计软件进行分析，计量数据以均数±标准差表示。组间比较采用多样本均数的One-Way ANOVA检验。p＜0.05差异有统计学意义。研究结果1．对照组大鼠胰腺组织无明显病理改变。模型组大鼠中，胰腺组织炎细胞浸润，间质水肿，腺泡萎缩。腺泡和胰岛细胞周围可见到大量微泡，局部还可见广泛的空泡化形成。部分小叶结构消失，小叶内和小叶间纤维结缔组织增生。与模型组大鼠比较，低剂量EGCG组大鼠胰腺组织空泡化程度明显减轻；而高剂量EGCG组大鼠胰腺组织结构接近正常。2．与对照组比较，模型组MDA含量显著升高，CuZn-SOD、GSH-PX活力明显降低；与模型组比较，各剂量EGCG组MDA含量显著下降（p＜0.001），CuZn-SOD、GSH-PX活力显著升高（p＜0.001），且高剂量与低剂量EGCG组比较差异也很显著（p＜0.001）。3．与对照组比较，模型组CuZn-SOD mRNA表达明显下调；与模型组比较，各剂量EGCG组CuZn-SOD mRNA表达显著上调（p＜0.001），而各剂量EGCG组之间比较也有显著性差异（p＜0.001）。4．模型组大鼠胰腺组织中胶原含量明显升高（p＜0.001）；给予EGCG后大鼠胰腺组织胶原含量明显减少（p＜0.001），而且这一作用呈剂量依赖性。5．免疫组织化学染色结果显示：对照组大鼠胰腺组织中仅见少量的α-SMA阳性细胞分布于血管和导管壁中；而模型组大鼠胰腺组织中，可见到大量α-SMA阳性细胞，主要分布于胰腺腺泡周围的纤维化区和胰腺的血管和导管壁；而EGCG组胰腺组织中α-SMA阳性细胞明显减少，其阳性表达平均光密度明显低于模型组（p＜0.001），高剂量与低剂量EGCG组比较α-SMA的表达也有显著差异（p＜0.01）。RT-PCR检测结果显示各组大鼠胰腺组中α-SMA mRNA的表达变化与蛋白的表达变化类似。6．正常对照组大鼠胰腺组织内只有零星分布的TGF-β₁、Smad3阳性细胞；Smad7表达丰富，主要在腺泡细胞、胰腺导管细胞的胞浆内，部分细胞核膜也有表达。模型组大鼠胰腺组织内TGF-β₁、Smad3表达明显增强，主要见于间质的纤维组织、腺泡细胞和胰腺导管细胞的胞质中；Smad7表达极少，主要在胰腺导管细胞的胞浆内。各剂量EGCG组大鼠胰腺组织中TGF-β₁、Smad3表达较模型组下降（p＜0.001），Smad7表达较模型组增强（p＜0.001），尤以高剂量组明显。RT-PCR检测结果显示各组大鼠胰腺组织中TGF-β₁、Smad3、Smad7 mRNA的表达变化与蛋白的表达变化类似。研究结论1．EGCG能明显改善纤维化大鼠胰腺组织病理学变化，有显著治疗胰腺纤维化的作用。2．EGCG通过诱导CuZn-SOD mRNA的表达、提高CuZn-SOD、GSH-PX活力，增强机体的抗氧化能力，阻断氧化过程，抑制脂质过氧化避免其对胰腺细胞长期攻击，从而减轻胰腺损伤，抑制胰腺纤维化。3．EGCG能够抑制大鼠PSCs活化，从而减少细胞外基质的产生，这可能是EGCG抗胰腺纤维化的细胞学基础。4．胰腺损伤后，TGF-β₁生成增多，而Smad3表达上调、Smad7表达下调促进了TGF-β₁的信号传导，进一步加强了TGF-β₁的促纤维化作用。EGCG不仅能够抑制TGF-β₁的产生，而且通过抑制起正反馈作用的Smad3的表达、促进起负反馈作用的Smad7表达，调节二者的平衡，削弱TGF-β₁的信号传导，在多水平阻止TGF-β₁发挥病理作用，这可能是EGCG抑制DDC诱导的大鼠胰腺纤维化的分子机制之一。研究意义本研究首次通过整体实验从氧化应激、细胞水平和分子水平这三个层次深入探讨了EGCG对实验性大鼠胰腺纤维化的作用和机制，结果表明EGCG能明显改善大鼠胰腺组织病理学变化，有显著治疗胰腺纤维化的作用。通过抗氧化应激而抑制PSCs活化，减少TGF-β₁产生，抑制TGF-β₁信号转导可能是EGCG抗胰腺纤维化的重要作用机制。本研究为临床上EGCG应用于抗胰腺纤维化治疗提供了初步的实验依据。