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第一部分同型半胱氨酸对树突状细胞黏附迁移及DC-SIGN表达的影响【目的】高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)是心血管疾病的独立危险因子，动脉粥样硬化(artherosclerosis，AS)目前被认为是一种炎症和免疫性疾病。本研究通过观察同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)对树突状细胞(dendritic cells，DCs)表面黏附分子DC-SIGN的表达，及对DC与内皮细胞(endothelial cells，ECs)、T淋巴细胞之间相互作用的影响，来探讨AS形成的可能机制。【方法】1、各种细胞的分离和培养：(1)用淋巴细胞分离液从健康成人外周血白细胞悬液分离单个核细胞，再用CD14~+磁珠分选出纯度大于98％的CD14~+单核细胞，用含20 ng/ml rhGM-CSF(recombinant human granulocyte macrophage-colony stimulating factor)、10ng／ml rhIL-4(recombinant human interleukin-4)、10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的RPMI1640培养基培养，第5天收集悬浮细胞作为未成熟DC(immature DC，imDC)，加100 ng／ml的LPS继续培养2天收集起来作为成熟DC(mature DC，mDC)。(2)用0.1％Ⅰ型胶原酶从健康产妇剖宫产脐带消化获得人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)，用含15％FBS，10ng/ml rhEGF(recombinant human epidermal growth factor)的M199培养基培养，用抗Ⅷ因子抗体鉴定呈阳性。(3)经37℃的RPMI1640培养基润洗的尼龙毛柱，加入2×10~7／ml的外周血单个核细胞37℃孵育1h，以1滴／s的速度收集滤液及洗液，即得到T淋巴细胞，可用于混合淋巴细胞反应。2、细胞干预：用0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mmol／L的Hcy干预imDC或mDC24h。3、各种指标的检测：用流式细胞术检测DC细胞表面分子的表达及吞噬能力，用黏附和迁移试验检测未成熟DC对EC黏附和迁移的能力，用混合淋巴细胞反应检测成熟DC刺激T淋巴细胞增殖的能力，用Western blot和免疫荧光染色检测DC表面DC-SIGN蛋白的表达。【结果】1、在倒置显微镜下见DC悬浮生长，聚集成簇，有大量胞质突起。2、mDC表面CD86、CD83、HLA-DR的表达较imDC明显升高，但CD80变化不大；不管是mDC还是imDC，用Hcy干预后，细胞表面分子的表达与未用Hcy干预的相比没有明显差异。3、用Hcy干预imDC，细胞的吞噬能力没有明显变化，mDC的吞噬能力较未成熟DC明显降低。4、在DC与T淋巴细胞比例为1：5时，0.1mmol／L以上浓度的Hcy可以产生与对照有差异的MLR(P＜0.01)；使用0.5mmol／L的Hcy干预mDC，可使两种细胞比例大于1：20时产生与对照组有差异的MLR(P＜0.05，P＜0.01)。其余各种比例和各种Hcy的浓度下，MLR均不明显。3、Hcy的浓度0.1 mmol／L开始，imDC对EC的黏附明显增加(P＜0.05)，并随Hcy浓度升高而更加明显(P＜0.01)，而抗人DC-SIGN抗体可以阻断DC对EC的黏附(P＜0.01)，且与对照组没有明显差异。4、经Hcy干预的imDC的迁移指数相对于对照组分别增加了7.4％、11.7％、16.7％(P＜0.05)、29.4％(P＜0.01)、27.0％(P＜0.01)，而抗人DC-SIGN抗体可以阻断DC迁移过EC。6、用0.5mmol／L的Hcy干预DC不同时间，12h时DC-SIGN的表达明显增加(P＜0.05)，24 h时达高峰(P＜0.01)。用不同浓度的Hcy干预DC24h后，用Western blot检测DC表面DC-SIGN的蛋白表达，当Hcy浓度到0.5mmol／L和1.0mmol／L时，DC-SIGN的蛋白表达叫对照组明显增加(P＜0.05)。用激光共聚焦显微镜观察了DC与EC黏附时DC表面DC-SIGN的表达，可见经浓度大于0.1mmol／L的Hcy干预后的DC在与EC黏附时其表面DC-SIGN的表达明显高于对照组(P＜0.01)。【结论】1、Hcy并不刺激DC成熟、分化及吞噬能力的改变；2、病理生理浓度的Hcy可一定程度的刺激mDC诱导的T淋巴细胞增殖；3、病理生理浓度的Hcy促进imDC与EC的黏附；4、病理生理浓度的Hcy促进imDC迁移穿过内皮；5、病理生理浓度的Hcy促进DC表面DC-SIGN的表达。第二部分DC-SIGN特异性适体的筛选【目的】树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)，DC-SIGN是DC表面一种新型的凝集素受体。本研究以DC-SIGN蛋白为靶分子，利用指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从随机ssDNA文库中筛选与DC-SIGN特异结合的寡核苷酸适配子，即适体(aptamer)，并对所筛选出的适体进行结构和功能的初步分析，为感染、肿瘤以及动脉粥样硬化的基因治疗提供理论和实验依据。【方法】1、构建长度为79nt的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间35个核苷酸为随机序列：5′-CGGGGATCCGGAATTCTCCTCACA-N35-GTATGTCGACGAAGCTTGCG-3′。合成上游引物：5′-CGGGGATCCGGAATTCTCCTCACA-3′，下游5′标记生物素引物：5′-Bio-CGCAAGCTTCGTCGACATAC-3′。2、把DC-SIGN蛋白包被于96孔酶联板上，先反筛去与BSA结合的非特异ssDNA，使不与BSA结合的ssDNA与DC-SIGN结合，然后把它们从酶联板上洗脱下来，用PCR扩增成一端带生物素的dsDNA，用链亲和素磁珠分离得到可用于下一轮筛选的ssDNA。3、筛选得到的产物进行纯化、克隆、测序。4、测定适体与DC-SIGN蛋白结合的亲和力及解离常数。【结果】以DC-SIGN蛋白为靶分子，进行了11轮SELEX筛选，分别测定第1、4、7、11轮ssDNA文库与DC-SIGN蛋白的结合比例，结果显示随着筛选轮数的增加，ssDNA与DC-SIGN蛋白结合的比例不断增加，表明与DC-SIGN蛋白特异结合的ssDNA序列得到明显的富集。第11轮筛选出的ssDNA适体群用不带生物素的引物通过PCR扩增为dsDNA，PCR产物回收纯化后进行克隆，随机挑选了26个克隆进行测序并分析其一级结构。合成这26条适体，测定它们与DC-SIGN蛋白结合的亲和力，并用非线性回归分析计算适体的K_d值，最终得到第16条适体K_d值最小为21.73nmol／L，即为与DC-SIGN蛋白亲和力最高的适体。【结论】1、本研究利用SELEX技术从随机ssDNA文库中筛选出DC-SIGN的特异性寡核苷酸适体。2、对适体进行纯化、克隆和测序得到它们的一级结构。3、第16条适体与DC-SIGN蛋白结合的亲和力较高，K_d值为21.73nmol／L，其序列为：GGCGAAAATTTGTGGATATAGAGGGTTACTCGGAT。第三部分DC-SIGN特异性适体对树突状细胞与内皮细胞和T淋巴细胞之间相互作用的影响【目的】树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内最强的专职抗原递呈细胞，DC-SIGN是DC表面一种新型的凝集素受体。我们已经利用指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技术从随机ssDNA文库中筛选得到与DC-SIGN特异结合的寡核苷酸适配子，即适体(aptamer)。本研究将观察该适体对DC与内皮细胞(endothelial cells，ECs)、T淋巴细胞之间相互作用的影响，为抗感染、抗肿瘤及动脉粥样硬化的基因治疗进一步提供理论和实验依据。【方法】1、各种细胞的分离和培养：(1)用淋巴细胞分离液从健康成人外周血白细胞悬液分离单个核细胞，再用CD14~+磁珠分选出纯度大于98％的CD14~+单核细胞，用含20ng/ml rhGM-CSF、10ng／ml rhIL-4、10％FBS的RPMI1640培养基培养，第5天收集悬浮细胞作为未成熟DC(immature DC，imDC)，加100ng／ml的LPS继续培养2天收集起来作为成熟DC(mature DC，mDC)。(2)用0.1％Ⅰ型胶原酶从健康产妇剖宫产脐带消化获得HUVECs，用含15％FBS，10ng／mlrhEGF的M199培养基培养，用抗Ⅷ因子抗体鉴定呈阳性。(3)经37℃的RPMI1640培养基润洗的尼龙毛柱，加入2×10~7／ml的外周血单个核细胞37℃孵育1h，以1滴／s的速度收集滤液及洗液，即得到T淋巴细胞，可用于混合淋巴细胞反应。2、DC的实验分组：(1)空白对照组；(2)0.5mmol／L Hcy组；(3)抗DC-SIGN抗体组；(4)0.5mmol／L Hcy+抗DC-SIGN抗体组；(5)DC-SIGN适体组；(6)0.5mmol／L Hcy+DC-SIGN适体组。3、各种检测指标：用黏附和迁移试验检测imDC对EC黏附和迁移的能力，用混合淋巴细胞反应检测mDC刺激T淋巴细胞增殖的能力。【结果】1、DC-SIGN特异性适体可以阻断被Hcy激活或者未激活的imDC对EC的黏附，且与抗体有相似的效果。2、DC-SIGN特异性适体可以阻断被Hcy激活或者未激活的imDC对EC的迁移，且与抗体有相似的效果。3、DC-SIGN特异性适体可以阻断被Hcy激活或者未激活的mDC诱导T淋巴细胞增殖，且与抗体有相似的效果。【结论】1、DC-SIGN特异性适体可以阻断imDC与EC的黏附。2、DC-SIGN特异性适体可以阻断imDC迁移穿过内皮。3、DC-SIGN特异性适体可以阻断mDC刺激T淋巴细胞增殖。