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目的:核桃(Juglans regia L.)是我国重要的经济林树种,研究核桃的花芽分化对于其品种改良、提质增产具有重要意义。先前的研究表明,一些GRAS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE,Repressor of ga1-3 and SCARECROW)成员在分生组织发育中起着重要作用。花芽分化伴随着顶端分生组织的持续分化,为了更好地理解核桃花芽分化的分子机制,探究是否有GRAS基因参与了核桃的花芽分化调控,对核桃中的GRAS基因家族进行研究。此外,CO(CONSTANS)基因、NF-Y(NUCLEAR FACTOR Y)基因以及FT(FLOWERING LOCUS T)基因均为花芽分化过程中的关键调控基因,且在模式植物中有关于CO蛋白及NF-Y蛋白,单独或者联合调控成花基因FT的报道。因此,探究在核桃花芽分化过程中JrCOs蛋白和JrNF-Ys蛋白协同调控JrFT基因转录的潜在作用机制,以期补充和完善核桃花芽分化的分子调控网络。方法:通过石蜡切片试验,对新疆轮台地区的四个核桃品种和阿克苏地区的两个核桃品种,处于生理分化和形态分化临界期前后的雌花芽形态变化的连续观察,对新疆核桃雌花芽的分化时期进行划分。基于生物信息学分析方法如进化分析、多序列比对、模体预测、共线性分析、共表达分析、实时荧光PCR表达验证及蛋白互作预测,对核桃的GRAS基因家族进行鉴定分析。选取早实核桃品种‘新新2号’(Juglans regia cv.Xinxin No.2)处于不同分化时期的雌花芽样品和与雌花芽形态分化始期同期叶芽样品,构建转录组测序文库,筛选雌花芽分化的关键调控基因,并从中克隆FT基因、FT基因启动子、CO基因和NF-Y家族基因。构建3个核桃CO基因、20个核桃NF-Y基因及核桃FT基因启动子的表达载体,通过酵母杂交试验探究了核桃NF-Y蛋白和CO蛋白对FT基因转录的潜在作用机制。结果和结论:(1)通过石蜡切片试验观察核桃雌花芽在生理分化和形态分化的临界分化期前后的形态分化,将雌花芽分化阶段简单化分为:F＿1(形态未分化期)、F＿2(形态分化始期)和F＿3(雌花原基分化期)。(2)在核桃的全基因组中鉴定出52个GRAS基因,将核桃GRAS基因家族划分为9个亚家族。基因复制分析表明,核桃中7个GRAS基因在拟南芥和葡萄中存在垂直同源基因,其中5个在核桃基因组内发生了基因复制。对核桃GRAS基因表达分析表明,JrCIGRa-b和JrSCL28a在雌花芽和叶芽间差异表达(p<0.01),JrCIGRa-b和JrSCL3b-d雌花芽发育不同阶段差异表达(p<0.01),此外,通过共表达分析鉴定出了3个核心调控基因(Jr GAIa、JrSCL3f和Jr SHRc),这些GRAS基因可能在核桃顶端分生组织发育中起着重要的调控作用。(3)采集核桃雌花芽样品F＿1、F＿2和F＿3及与叶芽样品JRL进行转录组测序和分析,共获得132154个unigene,长度从201bp到16831bp不等。对差异表达基因(DEGs,Differential Expression Genes)的分析表明,F＿1 vs F＿2、F＿1 vs F＿3和F＿2 vs F＿3三个组合中分别存在597、784和532个差异表达基因。比较F＿2 vs JRL结果表明,雌花芽与叶芽之间存在374个差异表达基因。在所有的差异表达基因里,筛选到了与开花时间相关的31个差异表达基因,并根据它们的表达量构建共表达网络,筛选出Jr CDF-2(CYCLING DOF FACTOR 2)、Jr CDF-3、Jr PRR7(PSEUDO RESPONSE REGULATOR 7)、Jr PRR7-1、Jr PRR7-2、Jr TPS1-1(TREHALOSE-6-PHOSPHATE SYNTHASE 1)可能为调控开花时间的核心差异表达基因。此外,对18个与开花时间相关的差异表达基因进行实时荧光PCR实验验证。(4)通过转录组测序数据筛选到了核桃的FT基因,并成功克隆FT基因525 bp的CDS(Coding Sequence)序列。核桃FT基因在雌花芽及叶芽中均有表达,且随着雌花芽分化的进行FT基因的表达量逐渐升高;获得了2051bp的核桃JrFT基因上游启动子序列(含51bp JrFT c DNA 5’端序列)。在JrFT基因的启动子含有结合NF-Y蛋白的CCAAT元件,及大量的光响应与激素响应的顺式作用元件;克隆得到了三个不同长度的核桃CO基因,片段大小分别为JrCO1(1122bp)、JrCO2(1251bp)、JrCO3(1053bp),它们均含有CCT(CO,CO-like,TOC1)保守结构域。三个JrCO基因分别聚类到三个不同的COL(CONSTANS-LIKE)亚家族,在核桃不同组织及雌花芽不同发育时期均有表达。(5)共鉴定出33个核桃NF-Y基因(JrNF-Ys),JrNF-Y基因家族由17个NF-YA基因、9个NF-YB基因和7个NF-YC基因组成。进化关系和模体分析表明,NF-Y基因结构在进化过程中保守与分化并存。功能和蛋白互作分析表明核桃的NF-Y蛋白具有营养期向生殖期过渡的时间调控、胚胎发育、长日光周期和开花、转录的正调控及参与脱落酸激活信号通路的功能,且各蛋白之间具有复杂的互作网络。鉴定到了两个差异表达的JrNF-Y基因(JrNF-YA11和JrNF-YA12),JrCO2的表达与JrNF-YA11和JrNF-YA12的表达呈正相关,JrCO1和JrNF-YA12的表达模式呈负相关。综上分析表明,JrNF-Ys可能通过与其它转录因子(TFs,transcription factors)共同调节开花基因的表达而参与开花调控。(6)成功构建了核桃3个核桃JrCO(JrCO1/JrCO2/JrCO3)的表达载体,20个JrNF-Y(包含7个JrNF-YA:A1/A2/A3/A5/A8/A9/A10/A11、7个JrNF-YB:B1/B3/B4/B6/B7/B8/B9和4个JrNF-YC:C1/C3/C4/C7)的表达载体以及核桃JrFT基因启动子(Jrp FT)的表达载体,并通过酵母单杂及酵母双杂试验对它们之间潜在的互作关系进行探究。酵母单杂交实验结果中三个JrCO蛋白均没有与JrFT基因的启动子发生互作,JrNF-YB4、JrNF-YB6和JrNF-YB8蛋白可与JrFT基因的启动子发生互作。酵母双杂实验的结果表明JrCO1蛋白可与JrNF-YB4、JrNF-YB6蛋白发生互作,推测JrCO蛋白可能通过与JrNF-YB蛋白结合形成多聚复合蛋白来结合JrFT启动子,进而实现调控JrFT基因的转录表达。本研究对核桃花芽分化阶段JrCOs和JrNF-Ys协同调控JrFT转录的分子机制进行探究,为后续更深入研究核桃花芽分化调控的分子机理提供了参考。