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背景:卵巢癌死亡率位居妇科恶性肿瘤之首,晚期卵巢癌除了以肿瘤细胞减灭术联合铂基化疗为主的传统治疗方法外,提高肿瘤患者自身抗肿瘤活性的免疫治疗是当前肿瘤治疗的一个重要研究方向。大量研究证实,非特异性免疫治疗中细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)治疗已在血液系统肿瘤和肺癌、胃癌、卵巢癌等实体肿瘤中广泛应用且疗效显著,其中CIK在治疗卵巢癌方面,作为晚期卵巢癌患者一线治疗后的维持治疗可以显著延长患者生存期,改善患者生存质量。然而,CIK治疗卵巢癌仍面临诸多问题,晚期卵巢癌患者免疫功能状态差,不能有效的激活抗肿瘤免疫反应,并且肿瘤组织存在免疫抑制的微环境,CIK较难浸润到肿瘤组织局部发挥作用。而沙培林(picibanil,OK432)是A组溶血性链球菌制剂,可促进树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟,增强抗原递呈作用,激活抗肿瘤免疫反应;改变肿瘤微环境,诱导T淋巴细胞向肿瘤组织局部浸润。多项临床研究表明,OK432可以有效控制卵巢癌腹水并降低卵巢癌复发率。那么,OK432能否提高CIK对卵巢癌的治疗效果?CIK联合OK432疗法在卵巢癌以及其他肿瘤中没有相关研究报道。目的:采用体外实验的方法,探讨OK432能否增强CIK对卵巢癌细胞的杀伤效果,初步探讨其作用机制,为卵巢癌患者探索一种安全有效的免疫治疗策略,从而延长患者生存期,改善患者生活质量。方法:1、分离健康人外周血单个核细胞,在干扰素-γ作用下,制备CIK原代细胞,在CD3mAb、白介素-1 α和白介素-2作用下,启动扩增CIK细胞。进行检菌、内毒素检测、细胞计数和观察细胞状态后,应用流式细胞仪检测CIK细胞免疫表型,将成熟的CIK细胞作为杀伤实验的效应细胞。2、卵巢癌细胞SKOV3、ES2以及OVCAR3经过复苏、培养以及传代,应用慢病毒载体构建稳定表达荧光素酶(luciferase,Luc)的卵巢癌细胞SKOV3-LUC、OVCAR3-LUC以及ES2-LUC作为杀伤实验的靶细胞。3、实验分五组,包括CIK组(单纯应用CIK)、OK432组(单纯应用OK432)、OK432预处理组(OK432过夜处理肿瘤细胞后去上清再应用CIK)、联合组(CIK联合OK432)以及对照组。预处理靶细胞后,按照效靶比5:1、10:1、20:1与效应细胞共培养4h后加入D-荧光素(底物),根据底物氧化发光产生的光量子数正相关于荧光素酶浓度,应用酶标仪检测各组卵巢癌细胞的杀伤作用,计算杀伤率。4、采用实时荧光定量PCR法检测各组卵巢癌细胞中细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10 和 IL-12 表达量。结果:1、从健康人外周血中分离纯化外周血单个核细胞,在细胞因子作用下,制备出CIK原代细胞并启动CIK细胞扩增。检菌和内毒素检测阴性后,应用流式细胞仪检测出CIK细胞表面分子CD4-CD8+69.6%、CD3+CD56+18%以及CD3+CCR7+32.5%。随着培养时间的延长,CD4-CD8+和CD3+CD56+T淋巴细胞百分比逐渐增加,CD3+CCR7+T淋巴细胞百分比迅速增加,第六天后逐渐下降,表明细胞不断分化为CIK细胞。2、应用慢病毒载体构建表达荧光素酶的卵巢癌细胞,荧光显微镜检测卵巢癌细胞广泛表达荧光素酶,表明标记成功。3、体外杀伤实验结果显示,CIK组、OK432预处理组以及联合组对卵巢癌细胞的杀伤率随着效靶比的增加,逐渐升高。在同一效靶比下,OK432预处理组和联合组比CIK组的杀伤率大,差异有统计学意义(P<0.05)。在OVCAR3-LUC效靶比为10:1、20:1时,联合组比OK432预处理组的杀伤率大,差异有统计学意义(P<0.05)。表明OK432预处理组和联合组比CIK组有更强的淋巴细胞抗肿瘤作用,且联合组比OK432预处理组有更强的淋巴细胞抗肿瘤细胞作用。OK432组对SKOV3-LUC、ES2-LUC、OVCAR3-LUC 的杀伤率分别为 4.33%、5.40%、5.45%,表明OK432对卵巢癌细胞有直接杀伤作用。4、实时荧光定量PCR检测细胞因子结果显示,针对SKOV3-LUC细胞,关于细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-1 β的表达,相对于CIK组,OK432预处理组和联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-2、IL-6的表达,相对于CIK组,OK432预处理组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-6的表达,相对于CIK组,联合组呈低表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-12的表达,联合组高于OK432预处理组,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-10的表达,相对于CIK组,联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。针对ES2-LUC细胞,关于细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-2的表达,相对于CIK组,OK432预处理组和联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-1 β的表达,相对于CIK组,联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-6的表达,相对于CIK组,OK432预处理组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-1 β、IL-2的表达,联合组高于OK432预处理组,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-10的表达,相对于CIK组,联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。针对OVCAR3-LUC细胞,关于细胞因子IL-12、IL-1β、IL-2、IL-6的表达,相对于CIK组,OK432预处理组和联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IFN-y的表达,相对于CIK组,联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-12、IL-1 β、IL-2的表达,联合组高于OK432预处理组,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-6的表达,OK432预处理组高于联合组,差异有统计学意义(P<0.05)。关于细胞因子IL-10的表达,相对于CIK组,OK432预处理组呈低表达,联合组呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05)。表明OK432预处理组和联合组相比CIK组发挥更强的免疫活化作用,联合组比OK432预处理组免疫活化作用更强。OK432促进免疫活化因子表达。结论:1、OK432能够增强CIK对卵巢癌细胞的杀伤作用,且随着效靶比的增加,OK432增强CIK的抗肿瘤作用更加明显。2、OK432增强CIK对卵巢癌细胞的杀伤作用,可能与OK432促进免疫活性因子分泌有关。