论文部分内容阅读
动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是冠心病、脑卒中及外周血管动脉粥样硬化性闭塞症等多种血管性疾病的主要病理基础。资料显示,动脉粥样硬化性疾病所导致的不良后果是我国中青年人群致残、致死的最主要病因,是亟待解决的严重危害人类健康的疾病。关于AS发病机制的探究一直是众多研究的热点话题,AS累及多种细胞,包括动脉系统管壁的内皮细胞和平滑肌细胞,也累及来源血液循环的单核-巨噬细胞。单核-巨噬细胞系统的激活、巨噬细胞向泡沫细胞的转化及泡沫细胞的不适当凋亡是AS斑块形成的关键环节和斑块不稳定的主要因素。因此,适当的阻断单核细胞向巨噬细胞转化及巨噬细胞泡沫化将有效延缓AS斑块的发生及进展。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）在近些年的研究中逐渐被认识的越来越清晰。对lnc RNA的定义一方面是其序列的长度在200个核苷酸以上,另一方面是不具有蛋白质编码功能。lnc RNA在数量上远远超过体内编码基因,在众多生命活动中发挥不可替代的调控作用,包括细胞增殖与凋亡、细胞和组织分化、细胞及器官衰老等各方面。许多学者已经证实lnc RNA在心血管系统相关的疾病中出现表达异常,参与包括内皮功能障碍、脂代谢异常、平滑肌细胞不适当增殖、泡沫细胞形成、炎症反应、氧化应激等,这可能成为动脉粥样硬化性疾病预测、诊断及病情监控的指标。淫羊藿苷（icariin,ICA）是传统中药淫羊藿中的有效活性成分之一,既往研究认为其能发挥抗骨质疏松、维持免疫系统平衡、抑制炎症反应、抗癌等多方面作用,近些年的研究发现其在保护心血管及抗AS方面发挥重要作用。本课题组前期的实验研究发现ICA具有延缓Apo E-/-小鼠AS进展的作用,但具体作用机制尚需进一步完善。本实验包括动物水平研究和体外细胞水平研究,采用了基因芯片技术、sh RNA技术、基因过表达技术、FISH、油红O染色、HE染色、免疫组织化学染色、CCK、流式细胞术、Western blot、RT-q PCR、ELISA等实验方法,探讨lnc RNA042398调控MAPK3影响巨噬细胞泡沫化的机制,并证实ICA通过lnc RNA042398调控MAPK3抑制巨噬细胞增殖与泡沫化发挥抗动脉粥样硬化作用。研究分为三部分;（1）Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化组织基因表达谱测定、生物信息学分析及差异表达基因的验证本部分实验采用高脂饮食喂饲Apo E-/-小鼠成功构建动脉粥样硬化动物模型。利用基因芯片进行主动脉lnc RNAs及m RNAs表达谱分析。对显著差异基因进行GO和Pathway富集分析,构建了Lnc RNA靶通路网络图和Lnc RNA-m RNA共表达网络图。GO富集分析显示MAPK3与胆固醇代谢及AS关系密切;Pathway富集分析显示NONMMUT042398参与趋化因子信号通路、MAPK信号通路、m TOR信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、TGF-β信号通路、TNF信号通路、toll样受体信号通路,这些信号通路与单核-巨噬细胞的趋化,炎症的激活、脂质代谢、细胞增殖、分化与凋亡等密切相关。Lnc RNA靶通路网络图显示Lnc RNA 042398是该网络中degree最高的基因;Lnc RNA-m RNA共表达网络中Lnc RNA 042398与MAPK3存在共表达关系。表明Lnc RNA 042398与MAPK3在AS发生发展过程中发挥重要作用。在Apo E-/-小鼠主动脉组织中行RT-q PCR验证了Lnc RNA 042398与MAPK3表达趋势与基因芯片结果一致。（2）Lnc RNA 042398调控MAPK3影响巨噬细胞增殖与泡沫化本部分实验首先应用氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）诱导RAW264.7细胞构建泡沫细胞模型。在泡沫细胞模型中验证lnc RNA042398及MAPK3表达,结果显示泡沫细胞模型中lnc RNA 042398表达上调,MAPK3表达下调,证实与基因芯片结果表达趋势一致。为进一步阐明lnc RNA 042398调控MAPK3是否影响巨噬细胞增殖与泡沫化,通过FISH法鉴定lnc RNA 042398主要位于细胞浆,预测其作用机制。在RAW264.7细胞中分别转染PLVX-IRES-NEO-NONMMUT 042398及PLVX-sh RNA-NONMMUT 042398慢病毒构建稳定转染细胞株。Lnc RNA 042398过表达RAW264.7细胞中MAPK3表达上调,lnc RNA 042398沉默后MAPK3表达下调,证实lnc RNA 042398负向调控MAPK3的表达。Lnc RNA 042398过表达促进ox-LDL诱导的RAW264.7细胞增殖,细胞内脂滴浸润更加明显,细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量增高,提示巨噬细胞泡沫化加重;MAPK3及CD36表达上调,SR-BI表达被抑制;细胞培养上清细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平增高;lnc RNA 042398沉默后上述结果与之相反。提示lnc RNA 042398调控MAPK3促进了巨噬细胞增殖与泡沫化。（3）淫羊藿苷通过lnc RNA 042398调控MAPK3抑制巨噬细胞泡沫化抗动脉粥样硬化研究体内实验证实,ICA可明显降低高脂喂饲的Apo E-/-小鼠血清中TC、LDL-C及ox-LDL水平,降低主动脉AS斑块面积比;减轻主动脉AS病理改变;升高主动脉组织中MAPK3及清道夫受体SR-BI的表达,下调CD36的表达,ICA具有抗动脉粥样硬化作用。体外实验证实,ICA通过lnc RNA 042398升高MAPK3及SR-BI表达,下调CD36的表达;降低细胞内总胆固醇和游离胆固醇含量;抑制巨噬细胞增殖与泡沫化,降低细胞培养上清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。ICA逆转了lnc RNA 042398过表达所致的巨噬细胞增殖与泡沫化改变。综上所述,本研究得出以下结论:（1）Lnc RNA 042398与MAPK3是小鼠主动脉AS病变表达谱中差异表达的基因,生物信息学分析示二者在AS进展过程中发挥重要作用。（2）体外实验证明,lnc RNA 042398负向调控MAPK3;lnc RNA 042398过表达促进了巨噬细胞增殖与泡沫化。ICA抑制ox-LDL诱导的RAW264.7细胞增殖与泡沫化,其抑制作用是通过lnc RNA 042398调控MAPK3介导CD36表达下调、SR-BI表达上调实现的。（3）体内实验证明,ICA具有抗动脉粥样硬化作用,其作用机制是通过lnc RNA 042398调控MAPK3介导CD36表达下调、SR-BI表达上调实现的。