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本研究采用In-Fusion酶系统将带有CMV启动子的8拷贝串联的转录因子CSL的结合位点的DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(pLVX-8XCSL-acGFP)。在293T细胞中转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒或对照质粒pLVX-acGFP,6小时后,再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒pETP-NICD或对照质粒pETP。转染48小时后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,并且用流式细胞仪进行荧光定量分析。然后,将pLVX-8XCSL-acGFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系 LNCaP,72小时后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度最强的5%及最弱的5%的细胞。提取这两部分细胞的RNA,并采用 qRT-PCR方法检测比较这两群细胞中的Notch1,Notch2以及 Notch信号通路下游靶基因 Hey1的表达水平。转染pLVX-8XCSL-acGFP的HEK-293T细胞中过表达NICD可显著增加细胞的荧光强度,定量分析显示和对照组相比荧光强度增加了约10倍。而转染pLVX-acGFP的293T细胞过表达 NICD,荧光强度则无明显改变。根据 pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞,荧光强度高的细胞中的Notch1,Notch2和Hey1表达水平也比较高。本研究实验证明在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告notch信号水平的有效工具,为进一步研究 Notch信号通路对前列腺肿瘤细胞的影响打下基础。 本文研究了TRIM家族成员TRIM59蛋白在乳腺癌中的生物学功能,为乳腺癌的治疗提供新的靶标。我们首先通过对多个数据库进行生物信息学检索分析发现,TRIM59在乳腺癌中显著高表达。为了研究TRIM59在乳腺癌发生发展中生物学功能,我们在乳腺癌细胞系 MDA-MB-231中分别构建了TRIM59-knockdown和TRIM59-overexpression的稳定细胞系,分别通过体外的细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell实验和体内的裸鼠成瘤实验来探究 TRIM59的具体作用。结果显示TRIM59敲低后,细胞的增殖减慢,克隆形成能力减弱,细胞的迁移能力下降;反之,TRIM59过表达后,细胞的增殖能力、克隆形成能力以及细胞的迁移能力均增强。体内裸鼠皮下成瘤实验与体外实验结果一致,TRIM59敲低后裸鼠成瘤能力下降;TRIM59过表达后,裸鼠成瘤能力增强。综上所述,体内和体外结果均显示TRIM59能够促进乳腺癌的生长和转移。