放线菌是一类高 GC含量的革兰氏阳性菌,目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌,具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化,故一直受到人们的关注。自上世纪六十年代,有关以A因子为代表的g-丁内酯类自诱导信号分子在链霉菌次级代谢与分化中的作用及其机制,已有大量报道。但是,在不同链霉菌中其调控作用和方式也不尽相同,尚存在不少需要深入研究的科学问题。深入研究g-丁内酯调控系统对链霉菌工业菌株的次级代谢的调控作用及其机制,将为如何利用代谢调控和代谢工程来提高抗生素的工业发酵水平提供重要的理论指导。　　井冈霉素,又称有效霉素,是一种由吸水链霉菌井冈亚种5008(简称5008)产生的C7N氨基环醇类抗生素。由于井冈霉素能抑制真菌生长,可高效防治水稻纹枯病,故被广泛用于我国和亚洲其他水稻产区。此外,井冈霉素及有效氧胺等其他井冈霉素生物合成的中间产物都可用于生产治疗II型糖尿病的药物。鉴于井冈霉素的重要性,本微生物代谢国家重点实验室邓子新院士团队在2005年鉴定完成了井冈霉素生物合成基因簇,2012年完成了5008的全基因组测序。本论文通过对基因组进行分析,在其染色体上找到了A因子调控相关的同源基因,这暗示5008中可能存在类A因子级联系统;有关类A因子级联系统对井冈霉素生物合成的调控则尚待研究。　　本文首先利用天蓝色链霉菌M145作为指示菌检测到了5008发酵液中的g-丁内酯信号分子。随后,将一种廉价的A因子结构类似物1,4-丁内酯(1,4-BL)应用于井冈霉素发酵,来考察其是否产生影响。5008菌株的摇瓶发酵实验结果表明,在发酵12小时添加10mM的1,4-BL可提高井冈霉素的产量达30%左右;转录分析结果表明,添加1,4-BL能提高adpA-H等A因子级联调控相关同源基因和井冈霉素合成基因簇的转录水平。在5008菌株的发酵罐实验中,添加1,4-BL也使井冈霉素产量提高约30%;同样,在工业菌株TL01(5008的高产诱变菌株)的发酵实验中,添加1,4-BL也显著促进了井冈霉素的合成。这些结果说明,添加1,4-BL是一种简单而且有效提高井冈霉素发酵水平的策略。据此,我们推测1,4-BL能影响5008中的类A因子级联系统,通过提高井冈霉素合成基因簇的转录水平进而提高抗生素的产量。　　随后,本研究进一步考察了1,4-BL促进井冈霉素生物合成的作用机理以及类A因子级联系统对井冈霉素的调控作用。通过全基因组的分析,找到了三个可能的ArpA同源蛋白ShbR1、ShbR2和ShbR3。体内基因缺失和体外圆二色谱分析的结果表明1,4-BL主要通过ShbR3发挥作用。凝胶迁移实验(EMSA)和转录分析实验结果表明,ShbR3可通过直接结合adpA-H的启动子来抑制其转录,而1,4-BL对ShbR3与adpA-H启动子的结合有一定的解除作用。通过缺失adpA-H基因,valABC的转录被完全抑制,valKLMN和valG的转录也被不同程度地被抑制了;并且HPLC和LC-MS的分析结果确认突变株丧失了合成井冈霉素的能力。另外,通过EMSA实验,发现 AdpA-H可特异性地结合在valKLMN与valABC启动子间区。以上结果表明, AdpA-H可结合在井冈霉素基因簇上,进而控制valABC以及其他操纵子的转录从而直接调控井冈霉素的生物合成。上述研究一方面揭示了1,4-BL能诱导抗生素(井冈霉素)合成的作用机制,同时也揭示了类A因子系统在其中所起的作用。　　在研究的同时,我们也注意到链霉菌染色体中多套afsA-arpA同源基因共存的现象。由于目前已有的研究都集中在单套afsA-arpA同源基因的调控机制上,故本研究探索了多套类A因子系统级联调控的作用机制。我们首先考察了5008中三套afsA-arpA同源基因在发酵过程中的转录,观察到这三套 afsA-arpA均为非沉默基因并且转录存在一定的时序性。基因缺失的实验结果表明:afsA的三个同源基因的失活会显著抑制井冈霉素发酵产量,抑制的幅度高达60~90%;失活arpA的三个同源基因shbR1,shbR2和shbR3之后,井冈霉素的发酵产量分别提高了29%,7.8%和15%。通过基因缺失及EMSA分析发现ShbR1能直接结合在adpA-H启动子上,缺失shbR1仅提高adpA-H在发酵24小时的转录水平,双缺失shbR1/R3使adpA-H的转录水平在发酵12小时也显著提高了,这表明ShbR1与ShbR3对adpA-H的转录调控具有时序性。进一步考察ShbR1与ShbR3的调控关系发现,ShbR1能直接结合在shbR3的启动子上,正调控shbR3的基因转录。在揭示上述调控机制之后,我们尝试通过双缺失 shbR1/R3来提高井冈霉素的发酵水平,结果发现基因双缺失能显著上调 valABC的转录水平,提高井冈霉素的产量达50%以上。针对工业高产菌株TL01,通过缺失shbR1/R3之后,最终井冈霉素发酵产量由19g/L提高到23g/L,同时发酵速度也加快,发酵周期缩短48小时。以上结果表明,解除shbR1与shbR3对adpA-H的负调控是一种有效的代谢调控改造的策略,可显著提高工业菌株的发酵水平。　　综上所述,添加A因子结构类似物1,4-BL是一种简单而有效的发酵策略,可显著提高井冈霉素的发酵产量,并有望应用于大规模工业化发酵;全局调控蛋白AdpA-H通过与井冈霉素基因簇中启动子区域相结合直接控制结构基因的转录从而实现对井冈霉素生物合成的调控;ShbR3可直接结合在adpA-H的启动子上负调控adpA-H的转录,1,4-BL可与ShbR3相互作用使得adpA-H的转录上调,进而促进抗生素的合成;在5008的多套afsA-arpA同源基因系统中,ShbR1与ShbR3能时序性地负调控adpA-H的转录,并且ShbR1能直接结合在shbR3的启动子上正调控shbR3基因的转录。同时缺失shbR1和shbR3是一种有效提高井冈霉素发酵产量的基因工程方法,可解除对adpA-H的转录抑制,使其转录位于较高水平,进而提高了井冈霉素合成基因簇的转录水平,实现了该抗生素的高产。