丝氨酸是一种具有重要生理学功能的中性氨基酸,被广泛应用在食品、化妆品和医药等领域。目前工业上主要通过提取法和酶法生产L-丝氨酸。利用微生物发酵法生产L-丝氨酸虽然具有一定的潜力,但由于缺乏高效率的生产菌株,因此工业化生产还不成熟。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对野生型Escherichia coli MG1655进行了系统的代谢工程改造,通过减弱L-丝氨酸的降解,增强L-丝氨酸合成酶类的表达以及改造转运系统,成功构建一株L-丝氨酸高效生产菌。（1）在大肠杆菌中依次敲除sdaA,sdaB,tdcG基因,阻断L-丝氨酸向丙酮酸的降解,构建菌株SER03。发酵结果显示,该菌株生长正常,可积累0.1 g/L L-丝氨酸。（2）为了强化L-丝氨酸的合成途径,本文过表达了L-丝氨酸从头合成途径的三个基因,并且引入磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH）编码突变基因serA*以解除终产物的反馈抑制,构建菌株SER06。发酵结果显示,菌株SER06的L-丝氨酸产量提高到5.4 g/L,但是菌体的生物量也下降了29.9%。（3）为了进一步提升L-丝氨酸积累量,本文过表达了半胱氨酸转运蛋白基因eam A,敲除了L-丝氨酸胞内转运蛋白基因sstT和sdaC,构建了SER10。摇瓶发酵结果显示,SER10的L-丝氨酸产量达到11.2 g/L,与SER05相比提高了107%。（4）针对L-丝氨酸向甘氨酸的降解,利用色氨酸操纵子启动子Ptrp调控丝氨酸羟甲基转移酶的表达,减弱了L-丝氨酸向甘氨酸的降解途径,显著增强了L-丝氨酸的合成。构建的菌株SER12摇瓶发酵24 h,L-丝氨酸产量达到13.5 g/L。最后,利用5 L发酵罐对重组菌株SER12进行分批补料发酵培养。发酵数据显示,该菌株经发酵罐培养28 h后,L-丝氨酸产量为22.3 g/L,糖酸转化率为0.2 g L-丝氨酸/g葡萄糖。