过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶,其结构大部分含有血红素辅基(铁原卟啉)。迄今为止研究最为深入的过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP),HRP具有催化活性强、酶活稳定等优点,广泛应用于生物传感器和临床诊断等领域。但是由于其价格昂贵,使用条件苛刻,制约了其在生产实践中的应用。LipL41是钩端螺旋体的主要脂蛋白,与血红素结合具有过氧化物酶活性,可与Protein G及其他功能蛋白进行融合表达,在酶联免疫吸附、电镜染色技术和半固相膜免疫信号转换等方面具有较大的应用潜力。由于LipL41过氧化物酶酶活性较低,限制了其应用。因此本试验利用定向进化技术,使目的基因随机突变和体外重组,从而构建高库容突变库,并通过基于克隆原位酶活测定的高通量筛选方法,目的提高了LipL41酶促活性,在免疫检测等领域提供了一种可溶性标记用酶。本试验首先选用易错PCR技术对LipL41基因进行随机突变,将突变基因转化到Rosetta大肠杆菌中,构建突变基因库,在LB平板上培养后喷洒酶显色底物,根据颜色深浅挑选出疑似正向突变体,经酶活测定验证,共获得9株分泌酶活较高的突变体,通过检测其酶活,发现其酶活提高率在10%-25%左右。为了进一步提高LipL41酶活,本试验利用DNA改组技术,对9株分泌高酶活突变体基因体外重组。通过筛选获得一株高酶活突变体LipL41-P101,相比野生型酶活提高1.9倍。最后对野生型和突变型酶学特性分析发现,野生型过氧化物酶热稳定性高于突变酶LipL41-P101。野生型过氧化物酶和突变酶LipL41-P101的最适反应温度均为30℃。在pH稳定性方面,pH在5-9时,野生酶相比突变酶LipL41-P101酶活稳定性较高。野生酶和突变酶LipL41-P101在pH=5时酶活稳定性最高。野生酶最适和突变酶LipL41-P101的最适pH均为6。本试验通过定向进化技术,选育出一株酶活显著提高的突变酶,为该酶的应用奠定基础。