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昆虫是地球上种类最多的动物群体,超过100多万种,在生态系统中占据重要地位。一般情况下,昆虫幼虫都是在腐烂的有机物中发育生长,而成虫往往成为导致植物和动物感染疾病的传播载体。因此,昆虫体内逐渐进化出了识别病原微生物和抵御细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的能力。除了特殊行为、保护色和机体物理屏障如角质表皮、鳞毛或甲壳外,昆虫还具有识别和清除体内异物的高效免疫系统。免疫系统研究是昆虫研究中最重要的基本问题之一,对于阐明生物的生长发育和起源进化具有重要意义。
果蝇(Drosophila melanogaster)由于具有容易饲养、产卵多、生命周期短以及具有粗大的多线染色体而便于进行基因定位等优点,己成为遗传学和发育生物学研究领域中重要的模式生物之一,对现代生命科学的发展作出了突出的贡献。
如今果蝇又成为研究昆虫和人类天然免疫的重要模式生物,它主要是通过体液免疫和细胞免疫来抵抗各种病原微生物的侵染。研究表明,果蝇的免疫基因表达主要受两种信号转导途径的调控,即Toll/dif信号转导途径和Imd/Relish信号转导途径。
本论文主要以野生型黑腹果蝇为材料,研究了果蝇在受到外界微生物侵染的条件下,其体内Dmloxl2基因的表达变化情况。我们以黑腹果蝇成虫为材料提取其总RNA,然后从中分离出mRNA,建立了果蝇成虫cDNA文库,得到大约为1×106个独立的克隆。这次构建的cDNA文库,为果蝇抗微生物相关基因Dmloxl2的克隆和结构功能研究奠定了基础。
我们利用培养至高浓度(600nm下细菌悬液光吸收在50以上)的四种常见微生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色链球菌)人工感染果蝇,以rp49为内参照基因,通过RT-PCR的方法检测果蝇体内Dmloxl2基因的表达变化情况,试验结果显示:黑腹果蝇在受到上述四种微生物侵染12 h后,Dmloxl2基因表达均呈现明显上调趋势。
为了进一步验证该实验结果,我们又用实时荧光定量PCR技术检测了Dmloxl2基因在上述四种微生物侵染12 h后的表达变化情况.试验结果显示:果蝇成虫在经过高浓度的E.coli感染时,Dmloxl2的表达上调1.8倍;果蝇成虫在经过高浓度的B.subtilis感染时,Dmloxl2的表达上调2.6倍;果蝇成虫在经过高浓度的S.aureus感染时,Dmloxl2的表达上调2.8倍;果蝇成虫在经过高浓度的C.albicans感染时,Dmloxl2的表达上调2.2倍。上述试验结果说明Dmloxl2基因在受到外界微生物的感染12 h后其表达显著上调,这也进一步验证了前文RT-PCR的实验结果。同时,我们也检测了Dmloxl2基因在上述四种微生物侵染6h后的表达变化情况,其表达也呈现上调趋势。