论文部分内容阅读
目的：提取中国野生菰米与稻米贮藏蛋白，利用SDS-PAGE电泳技术，对中国野生菰米蛋白质作出简单鉴定。再进一步采用双向电泳技术分离两者的总蛋白，获得高清晰的2-DE胶图谱，通过PDQest软件分析比较，找出中国野生菰米与稻米的差异蛋白质，经MALDI-TOF-MS鉴定，得到中国野生菰米的蛋白质确切的理化生物学信息，为中国野生菰作为稻米营养品质改良的资源，提供蛋白质组学的理论根据。
方法：
(1)采用0．05mol/L，pH 8.0Tris-HCI提取中国野生菰米与稻米的贮藏蛋白，用Bradford法定量蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳分离，所得的凝胶经扫描成像系统扫描后，用Quantity-one软件分析比较两者蛋白质的差异。
(2)采用改良的三氯乙酸一丙酮联用法提取中国野生菰米与稻米总蛋白，经Bradford法测定蛋白质的含量，标定两种蛋白质的样品浓度后进行2-DE分离，分离后的凝胶采用改进的胶体考马斯亮蓝G-250染色，脱色后经凝胶成像系统扫描，用PDQuest软件进行图像的分析处理，包括背景消减、斑点检测、匹配、分子量和等电点分析等，获取斑点位置坐标并找出差异蛋白。对差异蛋白进行MALDI-TOF-MS结果鉴定，得到相应各蛋白点的肽指纹图谱，再利用蛋白质分析软件与蛋白质数据库中的蛋白进行比对分析。
结果：
(1)中国野生菰米的贮藏蛋白主要为谷蛋白，含量大约是稻米的2倍，包括酸性亚基(37-39KD)和碱性亚基(22-23KD)。
(2)采用改良的三氯乙酸-丙酮联用提取蛋白的方法，经双向电泳分离后，获得了背景清晰，分辨率高，重复性好的2-DE胶图谱。
(3)经PDQuest软件搜索分析，2-DE胶图谱上中国野生菰米的蛋白点为68个，而稻米蛋白点的为123个。
(4)2-DE胶图谱上，中国野生菰米与稻米的高丰度蛋白点主要集中在分子量35-60KD，PH6-9.5之间。
(5)对2-DE胶图谱用PDQuest软件分析处理，选取菰米与稻米的差异蛋白点19个，最终质谱分析获得肽指纹图谱的蛋白点为17个。能够用Mascot软件搜索鉴定的差异蛋白质为16个(其中菰米14个，稻米2个)，菰米14个蛋白点中有3个鉴定为稻米谷蛋白，4个分别与稻米Os02g0249000蛋白、OSJNBa0033G05.12蛋白、H0413E07.3蛋白、Os06g0604500蛋白序列匹配，2个水稻属未命名蛋白，另外3个鉴定为中国野生菰谷蛋白前体蛋白，其余2个分别鉴定为苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶和绿藻动力联合蛋白。
结论：
(1)中国野生菰米贮藏蛋白中，谷蛋白含量明显高于稻米，醇溶蛋白则低于稻米，其必需氨基酸含量丰富，尤其是赖氨酸含量比较高，中国野生菰米的蛋白质营养品质高于稻米。
(2)中国野生菰米蛋白质与稻米有较高的同源性，在我们获得的菰米蛋白肽指纹图谱中，64％与稻米蛋白匹配。
(3)中国野生菰米蛋白质组分中除谷蛋白以外，还有苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶和绿藻动力联合蛋白。
(4)水稻2-DE胶图谱的蛋白种类约是野生菰米的1.8倍，远远大于野生菰的蛋白组成，表明中国野生菰属于进化系统树的上源植物，保留栽培稻进化后所不具有的营养优良品质。
(5)本研究发现的苎麻内源咖啡酰辅酶A甲基转移酶和绿藻动力联合蛋白，其功能和生物学作用及其对种子营养品质的影响有待进一步深入研究。