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第一部分杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其HLA-C配体基因与不明原因早期复发性自然流产的关联性研究第一节不明原因早期复发性自然流产患者夫妇双方杀伤细胞免疫球蛋白样受体及其HLA-C配体基因多态性的研究【目的】复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)病因复杂,其中近1/2原因不明,其免疫发病机理尚不清楚,近年来,母胎界面上自然杀伤细胞(NK细胞)的作用受到人们关注,NK细胞的功能主要通过其表面受体与靶细胞表面配体结合来调节,杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cellimmunoglobulin-like receptors,KIR)主要存在于NK细胞和部分T细胞表面,通过与靶细胞表面HLA配体识别调节NK细胞功能,编码KIR及其HLA配体的基因在人群中均具有高度多态性,本研究的目的是通过研究KIR及其HLA-C配体基因多态性与不明原因的早期复发性自然流产是否存在关联,探讨免疫遗传因素在RSA发病中的作用。【方法】筛选2004年2月-2007年1月我院就诊的73对不明原因的早期复发性自然流产患者夫妇,随机选取我院保健门诊进行健康查体的志愿者夫妇68对作为对照者,用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR/SSP)法,对每对入选者进行15种KIR基因和8种HLA-C基因位点的检测,比较RSA患者和正常对照者间KIR和HLA-C基因频率及分布有无统计学差异。【结果】1.RSA病例组KIR2DS1基因阳性率较对照组显著升高(P=0.029)。2.RSA病例组活化性KIR基因平均数较对照组显著升高(P=0.041)。3.RSA病例组中携带2个以上活化性KIR基因的个体较对照组明显增多,差异具有显著性(P=0.018)。4.RSA病例组中双方均检测到HLA-C第2组等位基因(Cw分子α重链上第80位为赖氨酸)的夫妇显著少于对照组,而RSA病例组中双方均未检测到HLA-C第2组等位基因的夫妇显著多于对照组,差异有统计学意义(P=0.005)。5.女方KIR2DL1基因阳性且夫妇双方都具有第2组Cw等位基因的患者显著少于对照者(P=0.007),女方KIR2DS1基因阳性且夫妇双方都具有第2组Cw等位基因的患者显著少于对照者(P=0.002)。6.KIR2DS1阳性患者夫妇双方第2组HLA-C等位基因组合分布与对照者差异有显著性(P=0.004)【结论】1.KIR2DS1基因阳性率的增高以及活化性KIR基因数目增多可能是不明原因早期复发性自然流产的发病原因之一。2.夫妇双方第2组HLA-C等位基因减少可能与不明原因早期复发性自然流产的发病有关。3.KIR2DS1基因阳性夫妇缺乏第2组HLA-C等位基因可能增加早期复发性自然流产的发病机率。第二节不明原因早期复发性自然流产患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因型分析【目的】探讨不明原因的早期复发性自然流产患者杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因型分布特点。【方法】采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR╱SSP)法,分析在我院就诊的95例不明原因复发性自然流产(RSA)患者和111例无血缘关系的正常妇女KIR基因型。【结果】RSA病例组2DL1~+,2DL2~+,2DL3~+,2DL4~+,2DL5~+,3DL1~+,3DL2~+,3DL3~+,2DS1~+,2DS2~+,2DS3~-,2DS4~+,2DS5~+,3DS1~+,KIR2DP1~+基因型阳性率最高,占14.74%,正常对照组2DL1~+,2DL2~-,2DL3~+,2DL4~+,2DL5~-,3DL1~+,3DL2~+,3DL3~+,2DS1~-,2DS2~-,2DS3~-,2DS4~+,2DS5~-,3DS1~-,KIR2DP1~+基因型阳性率最高,占20.72%,且RSA病例组2DL1~+,2DL2~+,2DL3~+,2DL4~+,2DL5~+,3DL1~+,3DL2~+,3DL3~+,2DS1~+,2DS2~+,2DS3~+,2DS4~+,2DS5~+,3DS1~+,KIR2DP1~+基因型阳性率较正常对照组显著升高(P=0.007)。【结论】RSA患者中有新的KIR基因型存在,RSA患者与正常对照者KIR基因型分布差异可能是RSA发病的原因之一。第二部分不明原因早期复发性自然流产患者蜕膜组织杀伤细胞免疫球蛋白样受体mRNA表达的研究【目的】探讨转录水平杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)在不明原因早期复发性自然流产(RSA)患者和正常对照者早孕子宫蜕膜组织中表达的差异。【方法】选择2006年1月至2007年6月我院就诊的RSA患者和同期我院计划生育门诊因计划外妊娠行人工流产术者各30例,并根据孕周分组,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2 mRNA在RSA患者和对照者早孕子宫蜕膜组织中的表达,应用SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR法检测KIR2DL1、2DL3mRNA在子宫蜕膜组织中的相对表达量,比较RSA患者和对照者早孕子宫蜕膜组织抑制性KIRmRNA表达的差异。【结果】1.蜕膜组织中检出KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2基因表达,其中RSA患者KIR2DL2表达率较正常对照组降低,但差异无统计学意义。2.RSA患者KIR2DL1、2DL3相对表达量较正常对照者降低,但差异无统计学意义。3.不同孕周的患者KIR2DL1、2DL3相对表达量较同期正常对照组降低,但差异无统计学意义。【结论】早孕蜕膜组织KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2mRNA的表达变化与不明原因早期复发性自然流产无直接关系。第三部分不明原因早期复发性自然流产患者蜕膜组织CD158a、CD158b受体表达的研究【目的】探讨不明原因早期复发性自然流产(RSA)患者和正常对照者早孕子宫蜕膜组织中杀伤细胞免疫球蛋白样受体CD158表达的特征。【方法】选择2006年1月至2007年6月我院就诊的RSA患者和同期我院计划生育门诊因计划外妊娠行人工流产术者各30例,并根据孕周分组,应用免疫荧光染色法和流式细胞术检测早孕蜕膜组织细胞表面标记,比较RSA患者和对照者CD56、CD16、CD158a(KIR2DL1)、CD158b(KIR2DL2/3)表达的变化规律。【结果】1.早孕子宫蜕膜组织小动脉和腺体周围可见大量CD56+细胞分布。2.RSA患者CD56+细胞数显著少于对照者(P=0.007),≤7孕周患者CD56+细胞数与同孕期对照者有极显著差异(P=0.004),随着孕周的增加差异减小。RSA患者CD56+CD16-细胞较对照者降低,差异有统计学意义(P＜0.05)3.RSA患者蜕膜单个核细胞CD158a在早孕各时期表达量均显著下降(P＜0.05),而CD158b在≤孕10周患者中表达量显著下降(P＜0.05),孕10周以上患者和对照者表达量无显著差异。4.RSA患者CD56+CD16-细胞表面CD158a表达量显著降低(P=0.026),按孕周分组分析显示孕7周-10周患者CD56+CD16-细胞表面表达CD158a较同期对照者显著降低(P=0.010)。5.正常早孕蜕膜组织CD158a、CD158b与CD56表达呈显著正相关。【结论】1.CD56+CD16-细胞为蜕膜单个核细胞的优势细胞群,早孕蜕膜组织CD56+CD16-细胞减少可能为不明原因自然流产的发病机制之一。2.CD56+CD16-细胞表面CD158a表达下降可能与不明原因自然流产有关。3.正常早孕蜕膜单个核细胞CD158a、CD158b与CD56表达呈显著正相关关系。