酶是一种具有高催化活性和特异性的生物催化剂,在临床诊断、食品工业和生物传感器等领域均有广泛的应用。但是游离酶敏感易失活且难以重复使用等缺陷限制了其在诸多领域的发展。固定化酶技术可以显著提高酶的稳定性,并实现酶的快速回收和重复利用,有效解决了上述游离酶存在的问题。然而,传统的酶固定化方法在不同程度上均存在一定的问题,因此需要进一步探索对酶分子活性损伤小且动态可逆的新型固定化酶方法。双链DNA互补介导固定化技术(DNA directed immobilization,DDI)是一种利用DNA分子杂交来实现生物分子固定化的新方法,其反应条件温和,能有效减少固定化过程对生物分子活性的影响,且具有较高的特异性和选择性以及良好的可逆性。尽管已有文献报道将DDI用于酶的可逆固定化,但是其在磁性载体表面固定的研究还鲜见报道,而且DDI在提高固定化酶的重复使用性和构建酶比例可控的多酶催化体系等方面还需进一步研究。因此,本论文利用DDI技术将酶固定到磁性纳米粒子表面,建立动态可逆的固定化酶反应器,并围绕提高催化效率,增强重复使用性和构建高活性的多酶体系三个方面展开研究,考察固定化酶动力学性质,为制备高活性、高稳定性和可逆性的磁控单酶或多酶微反应器奠定了一定的基础。主要研究内容如下:(1)利用DDI技术实现碱性磷酸酶在磁性纳米粒子表面的固定化,并将制备的固定化酶用于酶抑制剂筛选的分析研究。采用荧光共聚焦显微镜和热重分析等多种分析手段对固定化酶进行表征,结果证明碱性磷酸酶是通过DNA分子杂交固定到磁珠表面的。首次研究了DNA链长度对固定化酶催化活性的影响,发现当DNA片段长度为24个碱基对时,固定化碱性磷酸酶达到最大酶解效率,这为进一步提高DDI固定化酶的效率提供了新思路。此外,DDI固定化碱性磷酸酶表现出了较高的催化效率和良好的可逆性。以茶碱和L-苯丙氨酸作为抑制剂模型考察固定化碱性磷酸酶的抑制动力学,结果表明固定化碱性磷酸酶在较好的保留了自由酶酶学性质的同时,表现出对抑制剂更好的耐受能力,证明DDI技术作为一种温和高效、通用性强的固定化酶方法,有望在今后应用于高通量酶抑制剂筛选的研究。(2)通过多巴胺的自聚合制备聚多巴胺修饰的磁性纳米粒子,并利用DDI技术将胰蛋白酶固定到聚多巴胺修饰的磁珠表面,制备的固定化胰蛋白酶表现出了较高的催化效率和优秀的重复使用性。其中,以N-苯甲酞基-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE)为底物考察固定化胰蛋白酶的酶动力学性质,其特异性常数为1.82 s-1 μM-1,是自由酶的4.7倍,说明其具有较高的催化活性。此外,首次将聚多巴胺出色的生物相容性和缓冲能力与DDI技术的优势结合起来,大幅度提高了固定化胰蛋白酶的重复使用性,使其在重复使用70次后还保留有55%的活性。另外,采用马心肌蛋白为标准蛋白对DDI固定化胰蛋白酶的酶切效果进行评价,结果表明其相较于自由酶表现出了更高的酶切效率。基于DDI固定化胰蛋白酶具有较高的活性以及优秀的重复使用性,本工作为制备经济高效的固定化酶微反应器提供了新方法,并可在今后广泛应用于蛋白分析,临床诊断和食品工业等诸多领域。(3)通过超声法制备了多巴胺及其衍生物修饰的多功能磁性纳米粒子,并将葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根过氧化物酶(HRP)通过DDI技术共固定到磁珠表面。此多酶共固定化体系可对不同酶的固定化比例进行精确控制,且表现出了较高的催化效率、较好的磁回收率和良好的稳定性。首先,其结合了磁性纳米粒子的多功能性和DDI技术的高特异性,可通过调节磁珠表面官能团的比例,实现对GOx和HRP固定化比例的精确控制,且当GOx和HRP的摩尔比例为2:1时,其整体催化效率达到最大。此外,以β-D-葡萄糖为底物考察GOx-HRP多酶共固定化体系的动力学性质,结果显示其米氏常数和特异性常数分别为1.41 mM和5.02 s-1mM-1,大约是自由酶的2倍,证明此多酶共固定化体系具有较高的催化活性。而且,其还表现出了良好的稳定性、重复使用性和可逆性,为今后构建高活性、高稳定性且酶比例灵活可控的多酶共固定化体系开辟了新途径。