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IFN-γ主要由CD4+辅助T淋巴细胞,CD8+细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞产生,具有抗病毒和免疫调节作用。IFN-γ可调节抗病毒蛋白的表达,使细胞处于抗病毒的状态;可活化巨噬细胞,增强其呼吸爆发作用;可促进抗原递呈作用;可促进Thl细胞的分化;可诱导B细胞发生免疫球蛋白重链类别转换等。由于低等脊椎动物IFN-γ与哺乳动物IFN-γ相似性非常低,近年来才鉴定到硬骨鱼类的IFN-γ。本研究克隆了鳜和斜带石斑鱼的IFN-γ基因,研究它们与抗体产生水平等因子的关系,对鳜IFN-γ基因不同剪切异构体的抗病毒活性、免疫调节功能进行了较深入研究。
鳜和斜带石斑鱼IFN-γcDNA全长分别为1036bp和867bp,编码208和200个氨基酸,其基因组全长分别为6014和5104bp,其基因结构与其他脊椎动物IFN-γ的结构一致,由4个外显子和3个内含子组成。鳜IFN-γ的第3个内含子中包含一段长度为50bp的GA重复的微卫星序列。鳜和斜带石斑鱼的IFN-γ与高等脊椎动物的序列相似性较低,仅为32.5％-39％,与其他硬骨鱼类的IFN-γ相似性为38.0％-77.9％。PolyI:C能显著诱导斜带石斑鱼IFN-γ的表达,在胸腺中上调倍数最高,其次为头肾、脾脏、肾脏、皮肤和鳃。PolyI:C和LPS能显著诱导鳜IFN-γ的表达,在头肾和脾脏中上调倍数最高。此外,还获得了5种鳜IFN-γ剪切异构体,并通过原核表达获得融合蛋白。这些剪切异构体都具有抗病毒活性,并能调节IFN-γ所诱导的下游基因的表达。IFN-γ剪切异构体的重组蛋白刺激鳜头肾原代细胞12小时后,Mx、STAT1、IRFI的表达水平显著升高,为对照组的5-66倍,PKR、IRF2a、IRF2b、IRF7、STAT3、Igs和MHC_beta基因也上调表达,但上调倍数较低。
在鳜免疫球蛋白重链基因已经报道的基础上,对鳜IFN-γ基因的多态性与免疫球蛋白基因的表达和白细胞呼吸爆发活性的相关性进行了研究。在柱状黄杆菌感染后,IFN-γ的表达水平与白细胞呼吸爆发活性、IgM、lgD和IgZ的表达水平呈显著的正相关。此外,本研究还克隆得了斜带石斑鱼膜结合型免疫球蛋白M(mlgM),膜结合型免疫球蛋白D(mIgD),分泌型免疫球蛋白Z(slgZ)的重链基因。斜带石斑鱼mIgM重链恒定区包含3个恒定区外显子和2个跨膜外显子,各恒定区与牙鲆mIgM恒定区相似性最高,在53％-78％之间。mIgD的恒定区由1个μl外显子,7个δ外显子以及跨膜区组成,各恒定区与鳜IgD氨基酸序列相似性最高,δ1-δ7的相似性分别为75.5％、75.8％、65.4％、76.6％、88.1％、90.6％、82.8％,TM结构域为82.7％。斜带石斑鱼sIgZ的基因结构与其他硬骨鱼类相似,由4个恒定区外显子和3个内含子组成。RT-PCR结果显示斜带石斑鱼IgM在各组织中都有表达,IgD则主要在头肾、肾脏、脾脏和胸腺中表达。IgZ在头肾、肾脏、脾脏、鳃和心脏中均可见表达。经抗原物质刺激后12小时,IgM和IgD在各组织中的表达没有显著变化,IgZ基因在主要免疫器官中上调表达。经溶藻弧菌刺激后,斜带石斑鱼IgZ基因的表达水平与IFN-γ基因表达水平有显著的相关性。
干扰素调节因子(IRF)在抗病毒感染、固有免疫和适应性免疫调控、细胞增殖、凋亡、自稳平衡等方面发挥着重要的生物学效应。但是,对IRF家族基因起源与进化方面的研究较少。本研究通过生物信息学方法获得了脊椎动物IRF家族10个成员,还发现硬骨鱼类中存在2-3个IRF4类似基因,且在硬骨鱼类中发现了一个新的IRF家族成员,命名为IRF11。无脊椎的后口动物中存在2-10个IRF样基因,且与脊椎动物IRF家族成员之间的相似性较低。脊椎动物IRF家族成员的基因结构、基因座上相邻基因的共线性在进化过程中较为保守,表明IRF家族基因在脊椎动物中有着相似的进化模式。
综上所述,本研究克隆到了鳜和斜带石斑鱼IFN-γ基因,以及鳜IFN-γ的5种不同的剪切异构体,发现鳜IFN-γ的剪切异构体具有类似于哺乳动物IFN-γ的功能,在抗病毒感染和免疫调节作用方面取着重要作用。此外,通过分析脊椎动物IRF家族基因,发现硬骨鱼类IRF基因与哺乳类在进化上存在关联。本研究为近一步研究硬骨鱼类干扰素系统的调控机制奠定了良好基础。