脑膜炎是罗非鱼无乳链球菌病的特征性临床症状,建立罗非鱼无乳链球菌脑膜炎模型,并制定相应的临床症状及组织病理学评分系统,对研究罗非鱼无乳链球菌病的致病机制具有十分重要的意义。1、无乳链球菌感染尼罗罗非鱼的脑膜炎造模构建：将健康罗非鱼43尾,随机分为4组：1个对照组(n=10)和3个实验组(n=33)。其中,3组实验组根据不同感染剂量分为：1.0×106cfu组(n=11)、1,0×107cfu组(n=11)、1.0×108cfu组(n=11)。实验组分别将1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/mL的无乳链球菌菌液腹腔注射尼罗罗非鱼复制脑膜炎模型,0.1mL/尾：对照组相同剂量注射0.85%生理盐水。对实验组感染尼罗罗非鱼连续观察直至濒死或死亡,记录其临床症状、剖检病变、脑组织(端脑、中脑、小脑、延脑)病理学变化,并结合细菌学检测,按照拟定的评分系统评价各组脑膜炎的造模效果,确定最佳造模方案。实验结果显示：1、大体病理学变化：各实验攻毒组尼罗罗非鱼感染后2d均出现不同程度死亡,未见明显神经症状。感染后3 d至以后的几天鱼体开始出现异常活动的神经症状及突眼、角膜混浊等病理变化。2、组织病理学变化：感染尼罗罗非鱼的脑部出现软脑膜炎、脑膜脑炎等病理变化。蛛网膜下腔和脑软膜上出现大量炎性渗出物和染成蓝紫色微细颗粒的细菌团块；脑膜充血、水肿、疏松、增厚,有大量的中性白细胞等炎性细胞浸润；脑实质部基质疏松水肿,呈海绵状；脑组织内大量炎性细胞浸润、胶质细胞增生等。统计比较各组得分发现：107cfu组的无乳链球菌攻毒尼罗罗非鱼造模效果最好：临床症状显著而组内尼罗罗非鱼差异性最小,组织病理学观察患病尼罗罗非鱼病情和缓适中、利于观察研究,并可在攻毒后第3d成功构建脑膜炎模型,造模率为100%。2、尼罗罗非鱼无乳链球菌脑膜炎病理损伤的动态研究：健康尼罗罗非鱼152尾,实验组80尾以最优建模浓度的无乳链球菌(107cfu)攻毒尼罗罗非鱼,腹腔注射无乳链球菌稀释液0.5×108cfu/mL,每尾注射剂量为0.2mL；对照组72尾,每尾腹腔注射0.2mL 0.85%生理盐水。分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、 32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、60h、64h、68h、72h随机剖杀实验鱼4尾和对照组4尾,观察记录尼罗罗非鱼脑组织的大体病理学变化和组织病理学变化的动态变化过程。实验结果表明：在脑膜炎出现的早期(4-20h)大体病变主要为脑组织颜色变红,散在少量出血点；组织学可观察到脑膜及脑组织血管充、出血。中期(24-40h),大体病变主要为脑组织肿胀,脑脊液呈凝胶状；组织学可观察到神经细胞肿胀,间脑脑室出血少量絮状物(即脑脊液性状发生变化)。晚期((44-64h),大体病变主要为出现胶冻样脑脊液：组织学可观察到蛛网膜下腔大量中性粒细胞浸润。濒死期(68h—72h),大体病变主要为脑组织的软化、萎缩,可见液化坏死灶；组织学可观察到各部位脑基质溶解、疏松,部分出现脓性坏死灶,各部位神经纤维(特别是延脑神经纤维)严重断裂、溶解,并伴有血管反应,胶质细胞增生,嗜神经现象等。40h蛛网膜下腔开始出现少量无乳链球菌,72h蛛网膜下腔可见大量无乳链球菌存在。按照脑组织各部位出现坏死的时间来看,无乳链球菌侵袭各部位的时间顺序为：延脑(4h)——中脑(52h)——端脑(64h)——间脑(72h以后)——小脑(72h以后)。巨噬细胞在不同部位出现的先后顺序为：端脑(24h)——间脑(32h)——脑膜(52h)——延脑(72h)。3、无乳链球菌透明质酸酶多克隆抗体的制备。根据GenBank中登录的罗非鱼源无乳链球菌GD201008-001(GenBank登录号分别为CP003810.1)基因组序列针对hylB基因设计引物,对无乳链球菌透明质酸酶hytB基因进行克隆,成功获得重组质粒pMD19-T-hylB。将含粘性末端的目的序列与表达质粒pET32a(+)连接获得pET-32a(+)-hylB,连接产物转入表达载体BL21(DE3),成功构建表达质粒BL21-pET-32a(+)-hylB,原核表达目的蛋白。结果表明,37℃诱导表达4h,IPTG浓度为0.1mmol/L,无乳链球菌透明质酸酶重组蛋白大小为98.89KDa。鉴于表达质粒中的组氨酸与咪唑具有高亲和力,选择亲和层析的方法纯化目的蛋白,之后梯度尿素复性。将制备的纯化蛋白免疫两只健康家兔,兔抗透明质酸酶血清经琼脂扩散实验检测,重组透明质酸酶具有良好的免疫原性,制备的抗体效价为1：16。本实验获得的兔抗透明质酸酶血清可以用于后续免疫组化研究透明质酸酶在无乳链球菌动态侵袭罗非鱼过程中的作用,结合无乳链球菌感染鱼体过程中的动态分布,探讨无乳链球菌及其侵袭性酶的动态分布情况对不同脑组织造成的细胞损伤,研究其致病机制。