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研究背景
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是进展性失能性疾病，现阶段尚无有效缓解病情的治疗方式。随着全球人口老龄化程度加剧，AD的患病率逐年提高，有效的预防策略和治疗方法的发展极为紧迫。AD的发病机制复杂，β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉积、星形胶质变性、tau蛋白过度磷酸化和累积、神经元营养不良、氧化应激、线粒体功能障碍、生物金属动态平衡紊乱、乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)水平下降等均参与其中。
细胞外Aβ沉积形成老年斑和细胞内高磷酸化tau蛋白形成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)是阿尔茨海默病的主要病理特征。现阶段针对Aβ聚集、tau蛋白过度磷酸化后NFTs形成、神经炎症等病理过程的药物研发均以失败告终。因此证实AD是一系列病理事件共同平行参与下引起，而不是某一事件(像β淀粉样蛋白或者慢性炎症)引起的级联放大效应所致。AD治疗药物研发或治疗干预的最佳方向应是“一点多靶”或者“单一干预，多元效果”。
神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)具有自我更新的干细胞共性，以及定向神经分化的特性。NSCs移植是迄今为止治疗AD等中枢神经系统退行性疾病颇有希望的治疗方式。其通过多途径发挥保护作用:抑制β淀粉样蛋白聚集、抑制颅内小胶质细胞活化、促进内源性神经干细胞增生及神经元分化、促进内源性血管生成等。但NSCs的获取困难，临床应用存在伦理问题，同时由于宿主的免疫排斥和病理性微环境的破坏导致外源性移植细胞体内存活率低等问题很大程度上限制了NSCs移植治疗在临床中的应用。研究表明，神经干细胞条件培养基(NSC-conditioned medium，NSC-CDM)具有与神经干细胞类似的器官保护作用，且干细胞移植的主要机制并非细胞替代作用，而是依赖于病理微环境即干细胞旁分泌作用。所以，通过有效途径利用NSC-CDM(包含多种神经干细胞旁分泌物质)替代神经干细胞移植已成为一种新的治疗策略，且可以有效规避干细胞疗法存在的诸多限制。
线粒体功能障碍是AD的早期事件。Aβ定位积聚于线粒体，直接或间接破坏线粒体的结构和功能，诱导氧化应激，这些过程本身可促进Aβ的产生，进一步加重线粒体损伤导致恶性循环，最终神经元变性和凋亡。线粒体在细胞中具有另一个重要是调节程序性细胞死亡。Cytoc是线粒体启动凋亡的关键组成部分，Cytoc穿过线粒体膜，参与Caspase9的启动，并进一步激活Caspase3，从而导致凋亡。作为放大细胞凋亡信号的主要机制的一部分，线粒体保护可能是治疗剂的适当靶标。
与年龄相关的退行性疾病AD中，存在DNA和蛋白质等大分子结构和功能的退化。蛋白L异天冬氨酸-O-甲基转移酶1(Protein L-isoaspartate-O-methyltransferase 1，PCMT1)是保守基因PCMT1的产物，能选择性甲基化L-异天冬氨酸残基的羧基基团，将异天冬氨酸甲酯去甲基化，改造成琥珀酰亚胺，恢复正常的α连接，从而达到修复或者降解受损蛋白的目的。PCMT1在迄今为止研究的所有哺乳动物组织和细胞中均有表达，尤其在脑组织中更是具有高度特异性表达。近年来证实，PCMT1在许多生理过程中发挥多元调控的关键作用，如寿命、细胞凋亡、热休克反应、不同种类的氧化应激等。哺乳动物不育系20样蛋白激酶1(Mammalian Sterile 20-like protein kinase 1，MST1)是一种凋亡前蛋白，是经典Hippo信号通路的核心蛋白，其活性形式的MST1能诱导上调Bax、抑制Bcl-2、激活Caspase3，诱导细胞凋亡。研究表明PCMT1可能具有调控MST1的作用即PCMT1能抑制MST1活化，达到抑制细胞凋亡的效果。
综上所述，神经干细胞移植是治疗阿尔茨海默病最有希望的疗法之一，但其临床应用存在很多限制。神经干细胞条件培养基具有与神经干细胞类似的多途径保护作用，有效利用神经干细胞条件培养基能有效规避神经干细胞移植疗法所面临的诸多限制。因此，我们将探讨神经干细胞条件培养基对AD模型的保护作用，为神经干细胞条件培养基的临床转化提供理论支持。线粒体功能障碍贯穿阿尔茨海默病发生发展的始终，是治疗剂研究的靶标。我们将首先探讨神经干细胞条件培养基对线粒体功能的保护作用。PCMT1是哺乳动物细胞均表达的保守基因，参与细胞的基本生命活动，在阿尔茨海默病患者脑内活性显著下降。我们推测:神经干细胞条件培养基可通过上调保守基因PCMT1的表达，通过调控以MST1为核心蛋白的Hippo凋亡通路实现对神经细胞凋亡的干预，从神经细胞的“源头”调控细胞存活。进一步我们将探讨神经干细胞条件培养基是否通过PCMT1/MST1通路调控AD模型细胞凋亡，以期证实神经干细胞条件培养基的多途径保护机制。
第一部分神经干细胞条件培养基减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡
研究目的:
神经干细胞为神经元分化的前体细胞(来源)，自我更新能力强，旁分泌作用显著。富含其旁分泌产物的神经干细胞条件培养基有与神经干细胞类似的功能，且能规避干细胞疗法存在的诸多限制。我们使用Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤建立体外AD细胞模型，给予神经干细胞条件培养基干预，探讨其是否具有减轻AD细胞损伤的作用。
研究方法:
1、建立阿尔茨海默病的体外模型:用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞，通过CCK-8测定法检测细胞活力确定构建AD细胞模型的药物浓度、作用时间。
2、实验分为四组，分别为①对照(Control)组、②Aβ25-35(40μM)组、③Aβ25-35(40μM)+神经干细胞完全培养基(NSC-complete medium，NSC-CPM)组、④Aβ25-35(40μM)+神经干细胞条件培养基(NSC-CDM)组。
3、四组分别处理24h，行细胞活力及凋亡检测:①CCK-8测定法检测细胞活力;②TUNEL染色检测细胞凋亡;③流式细胞仪检测细胞凋亡。
4、使用GraphPad8.0软件分析数据。用单因素方差分析确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
1、Aβ25-35(30μM)在不同时间条件(12h、24h、36h、48h)下处理SH-SY5Y细胞，细胞存活率随时间降低。
2、不同浓度(10μM、20μM、30μM、40μM、50μM)Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞24h，随着Aβ25-35浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。与对照组相比，40μMAβ25-35处理SH-SY5Y细胞24h，细胞活力下降至(56.62±1.26)％，差异显著(**P＜0.01)。
3、CCK-8结果:与Control组相比，Aβ25-35组细胞活力显著下降(***P＜0.001)，NSC-CPM与NSC-CDM均逆转了Aβ25-35对SH-SY5Y细胞活力的影响(**P＜0.01)，NSC-CDM组比NSC-CPM组具有更高的细胞生存力(*P＜0.05)。
4、TUNEL染色结果:在Aβ25-35组细胞中清楚地观察到凋亡细胞的特征性核片段及浓缩的核和核碎片。在NSC-CPM或NSC-CDM组，TUNEL阳性细胞核数目显著低于Aβ25-35组(**P＜0.01)，NSC-CDM组阳性细胞核数目更低(*P＜0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡结果具有相同趋势。本章小结:
1、Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤具有浓度依赖及时间依赖，我们应用CCK-8检测细胞活性的方法确定建模条件:Aβ25-3540μM处理24h。
2、神经干细胞条件培养基(NSC-CDM)减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，逆转Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞活力下降，证实了NSC-CDM对AD细胞模型的保护作用。
第二部分神经干细胞条件培养基通过保护线粒体功能改善了Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤
研究目的:
线粒体功能障碍是阿尔茨海默病发病机制的一种，被认为是阿尔茨海默病的早期事件。Aβ沉积于线粒体，影响线粒体复合物功能，导致线粒体毒性及神经元凋亡。线粒体功能异常，产生高水平活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，对线粒体特定成分造成损伤，加重线粒体功能障碍。
线粒体在细胞中具有另一个重要功能是调节程序性细胞死亡。Cytoc是线粒体启动凋亡的关键组成部分，Cytoc穿过线粒体膜，参与Caspase9的启动，并进一步激活Caspase3，从而导致凋亡。
第一部分实验已证实神经干细胞条件培养基对AD细胞模型的保护作用，本部分我们将继续探讨其对线粒体功能及氧化应激的调节作用，明确神经干细胞条件培养基是否具有保护线粒体完整、维持线粒体功能正常的作用。
研究方法:
1、用浓度为40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h构建体外AD细胞模型。
2、实验分为四组，分别为①对照组、②Aβ25-35组、③Aβ25-35+NSC-CPM组、④Aβ25-35+NSC-CDM组。
3、实验方法:①蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测线粒体途径凋亡蛋白;②线粒体功能实验:线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)检测、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)检测、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量检测;③投射电子显微镜观察线粒体结构变化。
4、统计分析:使用GraphPad8.0软件分析数据。所有实验均重复三遍，分析中仅使用平均值±标准差(mean±SD)。用单因素方差分析(ANOVA)确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
1、浓度为40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h，细胞活力下降至(52.34±2.23)％，与对照组比***P＜0.001，建模成功。
2、WB法检测线粒体途径凋亡蛋白结果显示:与Control相比，Aβ25-35组的Cytochromec、Caspase9、Caspase3、Bax表达水平升高(**P＜0.01)，Bcl2表达水平降低(**P＜0.01);而NSC-CPM与NSC-CDM逆转了这些影响，NSC-CDM组优于NSC-CPM组(*P＜0.05)。
3、ROS测定表明，Aβ25-35组的ROS含量明显高于Control组(**P＜0.01)。NSC-CPM或NSC-CDM+Aβ25-35组的ROS含量明显低于Aβ25-35组(**P＜0.01)，NSC-CDM作用优于NSC-CPM(*P＜0.05)。MDA含量测定结果与ROS检测结果相似。与Control组比，Aβ25-35组MMP降低明显(**P＜0.01)，同样，NSC-CPM或NSC-CDM可以逆转这种影响，NSC-CDM作用更优(*P＜0.05)。
4、电镜观察各组线粒体形态:经过Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞中线粒体肿胀，尤其是线粒体嵴几乎消失或解体。在NSC-CPM及NSC-CDM+Aβ25-35组中，尽管大多数线粒体肿胀，但我们观察到一些正常的线粒体嵴。NSC-CDM+Aβ25-35组的线粒体肿胀比NSC-CPM+Aβ25-35组的线粒体肿胀轻，正常线粒体数量多。
本章小结:
1、以40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h建立AD细胞模型。
2、AD细胞模型经神经干细胞条件培养基干预后，线粒体途径凋亡蛋白(Cytochrome c、Caspase 9、Caspase 3、Bax)表达降低，ROS及MDA含量下降，MMP升高，且作用优于神经干细胞完全培养基NSC-CPM，证实神经干细胞条件培养基NSC-CDM(NSCs旁分泌的某些成分)通过线粒体保护作用减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤。
第三部分神经干细胞条件培养基通过PCMT1/MST1途径减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤
研究目的:
神经干细胞是神经元的前体细胞(来源)，而PCMT1是哺乳动物均表达的保守基因，其基本功能为修复衰老蛋白，作用底物众多，参与细胞的基本生命活动，故在神经元分化及修复过程中PCMT1可能起到重要作用。
研究证实PCMT1与MST1在细胞内共定位，PCMT1可能为MST1的上游调控因子，而MST1为经典Hippo凋亡通路的核心蛋白。同时MST1具有抑制自噬、诱导凋亡的多途径作用。
由此我们推测神经干细胞条件培养基可能通过作用于PCMT1/MST1通路对神经细胞凋亡产生调控。本部分实验我们将探讨NSC-CDM是否通过此通路起到细胞保护作用。
研究方法:
第一节
生信分析的方法分析PCMT1在AD患者与正常老年人脑中的表达差异。
①从基因表达数据库GEO下载数据集GSE5281，本数据库包括AD患者与正常老年人海马、内颞叶、后扣带回三个不同脑区基因表达数据，均排除了年龄因素的影响。其中海马区，AD患者10例，正常对照13例;内颞叶区，AD患者16例，正常对照12例;后扣带回，AD患者9例，正常对照13例。
②用Limma包进行差异表达基因分析，分析PCMT1基因是否存在差异表达，差异是否显著。
第二节
1、实验分组如上，四组(①对照组、②A25-35组、③Aβ25-35+NSC-CPM组、④Aβ25-35+NSC-CDM组)培养24h，分别行WB法及实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测PCMT1的表达。
2、PCMT1过表达及沉默效率评价与筛选;WB法和qRT-PCR法检测各组PCMT1的表达。
3、正式实验分两大组:
第一组:①正常对照组(Controlcheck，CC组)、②阴性对照组(Negativecontrol，NC组)、③沉默表达PCMT1组(sh-PCMT1组)、④沉默表达PCMT1+NCS-CDM组(sh-PCMT1+NSC-CDM组)。
第二组:①空载质粒组(Vector组)、②过表达PCMT1组(PCMT1-OV组)、③Aβ25-35(40μM，24h)+空载质粒组(Aβ25-35组)、④过表达PCMT1+A25-35(40μM,24h)组(Aβ25-35+PCMT1-OV组)。
5、两大组分别检测:①CCK-8测定法检测细胞活力、②TUNNEL染色法检测细胞凋亡、③WB法检测凋亡相关蛋白含量、④WB法检测PCMT1、总MST1(T-MST1)、磷酸化MST1(p-MST1)表达量。
6、统计分析:使用GraphPad8.0软件分析数据。用单因素方差分析确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
第一节
1、海马区，年龄因素:Control(79.62±2.61)vs.AD(77.80±1.81)，P=0.424，无统计学差异;内颞叶区，年龄因素Control(80.08±2.82)vs.AD(79.13±1.59)，P=0.780，无统计学差异;后扣带回，年龄因素Control(79.77±2.61)vs.AD(77.00±1.89)，P=0.210，无统计学差异。
2、利用Limma对从GEO数据库下载的GSE5281数据集的差异基因分析发现在AD患者与正常老年人的hippocampus、medialtemporalgyrus和posteriorcingulate三个脑区，PCMT1均呈现显著的表达下降***P＜0.001。
第二节
1、WB结果显示:与Control组相比，Aβ25-35组的PCMT1表达水平下降(***P＜0.001);与Aβ25-35组相比，NSC-CDM组PCMT1表达明显上调(**P＜0.01)，高于NSC-CPM组。qRT-PCR法检测结果有相同趋势。
2、质粒转染效率评价与筛选:与NC组相比，sh-PCMT1组PCMT1的mRNA和蛋白表达明显降低(**P＜0.01);与Vector组相比，PCMT1-OV组PCMT1的mRNA和蛋白表达明显增加(***P＜0.001)。构建转染质粒效果良好。
3、CCK-8结果显示:sh-PCMT1组与NC组相比，SH-SY5Y细胞活力下降(**P＜0.01)，PCMT1-OV组较Vector组有更高的细胞活力(*P＜0.05);与Aβ25-35+Vector组比，Aβ25-35+PCMT1-OV组细胞活力明显升高(**P＜0.01)，表明过表达PCMT1逆转了Aβ25-35抑制细胞活力的作用。TUNEL染色结果显示，sh-PCMT1组较NC组凋亡细胞数量增加(**P＜0.01)，PCMT1的过表达逆转了Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞的凋亡作用(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)。
4、WB结果显示:与NC相比，sh-PCMT1组Bcl2/BAX显著下降(**P＜0.01)、Cleavedcaspase3/Caspase3显著升高(*P＜0.05);Aβ25-35诱导损伤后，Bcl2/BAX显著下降(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01)，Cleavedcaspase3/Caspase3显著升高(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01);再经PCMT1过表达处理，Bcl2/BAX下降趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)，Cleavedcaspase3/Caspase3升高趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)。
5、WB结果显示:沉默PCMT1，PCMT1的表达水平显著降低(NC组vs.sh-PCMT1组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1升高(NC组vs.sh-PCMT1组，**P＜0.01);过表达PCMT1，PCMT1表达升高(PCMT1-OV组vs.Vector组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1下降(PCMT1-OV组vs.Vector组，**P＜0.01);Aβ25-35诱导损伤后，PCMT1的表达水平显著降低(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1升高(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01);再经PCMT1过表达处理，p-MST1/T-MST1升高趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vS.Aβ25-35+PCMT1-OV组，*P＜0.05)。
本章小结:
1、生信分析结果表明，与正常老年人相比，AD患者海马、内颞叶、后扣带回三个脑区PCMT1基因显著下调。
2、与对照相比，AD细胞模型PCMT1表达显著下降。
3、AD细胞模型经NSC-CDM干预后，PCMT1下降趋势被逆转，证实NSC-CDM可上调AD细胞模型的PCMT1表达。
4、①与阴性对照比，沉默PCMT1后，细胞活力下降，细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白表达上调;②与质粒空载组比，过表达PCMT1，细胞活力升高，凋亡相关蛋白表达下降;③与质粒空载组比，Aβ25-35损伤细胞后，细胞活力下降，细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白表达上调;④与Aβ25-35损伤组比，过表达PCMT1后，细胞活力升高，细胞凋亡减少，凋亡相关蛋白表达下降。以上结果证明，PCMT1调控细胞凋亡，上调PCMT1可减少Aβ25-35诱导的细胞凋亡。
5、①与阴性对照比，沉默PCMT1后，MST1磷酸化上调;②与质粒空载组比，过表达PCMT1，MST1磷酸化降低;③与质粒空载组比，Aβ25-35损伤细胞后，MST1磷酸化上调;④与Aβ25-35损伤组比，过表达PCMT1后，MST1磷酸化降低。以上结果证明，PCMT1调控MST1磷酸化，上调PCMT1可抑制Aβ25-35诱导的MST1磷酸化。
综上所述，神经干细胞条件培养基NSC-CDM上调PCMT1表达;PCMT1具有抑制细胞凋亡的作用;PCMT1具有抑制MST1磷酸化(活化)的作用。即神经干细胞条件培养基上调PCMT1表达，通过抑制MST1活化，作用于经典Hippo凋亡通路，减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
结论
结合研究背景，我们围绕神经干细胞条件培养基是否具有多途径神经保护作用设计并实施了相应的实验，取得以下成果:
1、我们发现Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤具有时间及浓度依赖，建模条件为40μMAβ25-35作用24h，此条件下，细胞活力下降至(56.62±1.26)％。
2、我们应用CCK8检测法、TUNEL染色法、流式细胞仪检测三种方法证实神经干细胞条件培养基具有减少Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用。
3、我们应用WB检测线粒体途径凋亡蛋白、电镜观察线粒体结构、流式检测线粒体膜电位等方法证实神经干细胞条件培养基维持线粒体结构及功能的完整性，通过线粒体保护作用减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤。
4、用生信分析的方法对阿尔茨海默病患者与正常老年人相同脑区神经元细胞进行基因差异表达分析发现，PCMT1基因在AD患者三个脑区中的表达均显著下调。
5、应用质粒转染的方法沉默与过表达PCMT1基因，发现PCMT1具有调控SH-SY5Y细胞生存的作用:沉默PCMT1，细胞活力下降，凋亡增加;过表达PCMT1，细胞活力升高。PCMT1具有调控MST1磷酸化(活化)的作用:沉默PCMT1，MST1磷酸化增强;过表达PCMT1，MST1磷酸化下降。
6、我们发现神经干细胞条件培养基能逆转Aβ25-35诱导的PCMT1表达下调;过表达PCMT1能逆转Aβ25-35诱导的MST1磷酸化增强。证明神经干细胞条件培养基通过上调PCMT1表达，抑制MST1磷酸化，作用于Hippo通路，减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
综上所述，实验证实神经干细胞条件培养基通过多途径(“一点多靶”)保护机制减轻Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的损伤。这为神经干细胞条件培养基的临床转化提供了理论支持。
阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是进展性失能性疾病，现阶段尚无有效缓解病情的治疗方式。随着全球人口老龄化程度加剧，AD的患病率逐年提高，有效的预防策略和治疗方法的发展极为紧迫。AD的发病机制复杂，β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉积、星形胶质变性、tau蛋白过度磷酸化和累积、神经元营养不良、氧化应激、线粒体功能障碍、生物金属动态平衡紊乱、乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)水平下降等均参与其中。
细胞外Aβ沉积形成老年斑和细胞内高磷酸化tau蛋白形成神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)是阿尔茨海默病的主要病理特征。现阶段针对Aβ聚集、tau蛋白过度磷酸化后NFTs形成、神经炎症等病理过程的药物研发均以失败告终。因此证实AD是一系列病理事件共同平行参与下引起，而不是某一事件(像β淀粉样蛋白或者慢性炎症)引起的级联放大效应所致。AD治疗药物研发或治疗干预的最佳方向应是“一点多靶”或者“单一干预，多元效果”。
神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)具有自我更新的干细胞共性，以及定向神经分化的特性。NSCs移植是迄今为止治疗AD等中枢神经系统退行性疾病颇有希望的治疗方式。其通过多途径发挥保护作用:抑制β淀粉样蛋白聚集、抑制颅内小胶质细胞活化、促进内源性神经干细胞增生及神经元分化、促进内源性血管生成等。但NSCs的获取困难，临床应用存在伦理问题，同时由于宿主的免疫排斥和病理性微环境的破坏导致外源性移植细胞体内存活率低等问题很大程度上限制了NSCs移植治疗在临床中的应用。研究表明，神经干细胞条件培养基(NSC-conditioned medium，NSC-CDM)具有与神经干细胞类似的器官保护作用，且干细胞移植的主要机制并非细胞替代作用，而是依赖于病理微环境即干细胞旁分泌作用。所以，通过有效途径利用NSC-CDM(包含多种神经干细胞旁分泌物质)替代神经干细胞移植已成为一种新的治疗策略，且可以有效规避干细胞疗法存在的诸多限制。
线粒体功能障碍是AD的早期事件。Aβ定位积聚于线粒体，直接或间接破坏线粒体的结构和功能，诱导氧化应激，这些过程本身可促进Aβ的产生，进一步加重线粒体损伤导致恶性循环，最终神经元变性和凋亡。线粒体在细胞中具有另一个重要是调节程序性细胞死亡。Cytoc是线粒体启动凋亡的关键组成部分，Cytoc穿过线粒体膜，参与Caspase9的启动，并进一步激活Caspase3，从而导致凋亡。作为放大细胞凋亡信号的主要机制的一部分，线粒体保护可能是治疗剂的适当靶标。
与年龄相关的退行性疾病AD中，存在DNA和蛋白质等大分子结构和功能的退化。蛋白L异天冬氨酸-O-甲基转移酶1(Protein L-isoaspartate-O-methyltransferase 1，PCMT1)是保守基因PCMT1的产物，能选择性甲基化L-异天冬氨酸残基的羧基基团，将异天冬氨酸甲酯去甲基化，改造成琥珀酰亚胺，恢复正常的α连接，从而达到修复或者降解受损蛋白的目的。PCMT1在迄今为止研究的所有哺乳动物组织和细胞中均有表达，尤其在脑组织中更是具有高度特异性表达。近年来证实，PCMT1在许多生理过程中发挥多元调控的关键作用，如寿命、细胞凋亡、热休克反应、不同种类的氧化应激等。哺乳动物不育系20样蛋白激酶1(Mammalian Sterile 20-like protein kinase 1，MST1)是一种凋亡前蛋白，是经典Hippo信号通路的核心蛋白，其活性形式的MST1能诱导上调Bax、抑制Bcl-2、激活Caspase3，诱导细胞凋亡。研究表明PCMT1可能具有调控MST1的作用即PCMT1能抑制MST1活化，达到抑制细胞凋亡的效果。
综上所述，神经干细胞移植是治疗阿尔茨海默病最有希望的疗法之一，但其临床应用存在很多限制。神经干细胞条件培养基具有与神经干细胞类似的多途径保护作用，有效利用神经干细胞条件培养基能有效规避神经干细胞移植疗法所面临的诸多限制。因此，我们将探讨神经干细胞条件培养基对AD模型的保护作用，为神经干细胞条件培养基的临床转化提供理论支持。线粒体功能障碍贯穿阿尔茨海默病发生发展的始终，是治疗剂研究的靶标。我们将首先探讨神经干细胞条件培养基对线粒体功能的保护作用。PCMT1是哺乳动物细胞均表达的保守基因，参与细胞的基本生命活动，在阿尔茨海默病患者脑内活性显著下降。我们推测:神经干细胞条件培养基可通过上调保守基因PCMT1的表达，通过调控以MST1为核心蛋白的Hippo凋亡通路实现对神经细胞凋亡的干预，从神经细胞的“源头”调控细胞存活。进一步我们将探讨神经干细胞条件培养基是否通过PCMT1/MST1通路调控AD模型细胞凋亡，以期证实神经干细胞条件培养基的多途径保护机制。
第一部分神经干细胞条件培养基减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡
研究目的:
神经干细胞为神经元分化的前体细胞(来源)，自我更新能力强，旁分泌作用显著。富含其旁分泌产物的神经干细胞条件培养基有与神经干细胞类似的功能，且能规避干细胞疗法存在的诸多限制。我们使用Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤建立体外AD细胞模型，给予神经干细胞条件培养基干预，探讨其是否具有减轻AD细胞损伤的作用。
研究方法:
1、建立阿尔茨海默病的体外模型:用Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞，通过CCK-8测定法检测细胞活力确定构建AD细胞模型的药物浓度、作用时间。
2、实验分为四组，分别为①对照(Control)组、②Aβ25-35(40μM)组、③Aβ25-35(40μM)+神经干细胞完全培养基(NSC-complete medium，NSC-CPM)组、④Aβ25-35(40μM)+神经干细胞条件培养基(NSC-CDM)组。
3、四组分别处理24h，行细胞活力及凋亡检测:①CCK-8测定法检测细胞活力;②TUNEL染色检测细胞凋亡;③流式细胞仪检测细胞凋亡。
4、使用GraphPad8.0软件分析数据。用单因素方差分析确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
1、Aβ25-35(30μM)在不同时间条件(12h、24h、36h、48h)下处理SH-SY5Y细胞，细胞存活率随时间降低。
2、不同浓度(10μM、20μM、30μM、40μM、50μM)Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞24h，随着Aβ25-35浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。与对照组相比，40μMAβ25-35处理SH-SY5Y细胞24h，细胞活力下降至(56.62±1.26)％，差异显著(**P＜0.01)。
3、CCK-8结果:与Control组相比，Aβ25-35组细胞活力显著下降(***P＜0.001)，NSC-CPM与NSC-CDM均逆转了Aβ25-35对SH-SY5Y细胞活力的影响(**P＜0.01)，NSC-CDM组比NSC-CPM组具有更高的细胞生存力(*P＜0.05)。
4、TUNEL染色结果:在Aβ25-35组细胞中清楚地观察到凋亡细胞的特征性核片段及浓缩的核和核碎片。在NSC-CPM或NSC-CDM组，TUNEL阳性细胞核数目显著低于Aβ25-35组(**P＜0.01)，NSC-CDM组阳性细胞核数目更低(*P＜0.05)。流式细胞仪检测细胞凋亡结果具有相同趋势。本章小结:
1、Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤具有浓度依赖及时间依赖，我们应用CCK-8检测细胞活性的方法确定建模条件:Aβ25-3540μM处理24h。
2、神经干细胞条件培养基(NSC-CDM)减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，逆转Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞活力下降，证实了NSC-CDM对AD细胞模型的保护作用。
第二部分神经干细胞条件培养基通过保护线粒体功能改善了Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤
研究目的:
线粒体功能障碍是阿尔茨海默病发病机制的一种，被认为是阿尔茨海默病的早期事件。Aβ沉积于线粒体，影响线粒体复合物功能，导致线粒体毒性及神经元凋亡。线粒体功能异常，产生高水平活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，对线粒体特定成分造成损伤，加重线粒体功能障碍。
线粒体在细胞中具有另一个重要功能是调节程序性细胞死亡。Cytoc是线粒体启动凋亡的关键组成部分，Cytoc穿过线粒体膜，参与Caspase9的启动，并进一步激活Caspase3，从而导致凋亡。
第一部分实验已证实神经干细胞条件培养基对AD细胞模型的保护作用，本部分我们将继续探讨其对线粒体功能及氧化应激的调节作用，明确神经干细胞条件培养基是否具有保护线粒体完整、维持线粒体功能正常的作用。
研究方法:
1、用浓度为40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h构建体外AD细胞模型。
2、实验分为四组，分别为①对照组、②Aβ25-35组、③Aβ25-35+NSC-CPM组、④Aβ25-35+NSC-CDM组。
3、实验方法:①蛋白质印迹法(Western blot，WB)检测线粒体途径凋亡蛋白;②线粒体功能实验:线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential，MMP)检测、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)检测、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量检测;③投射电子显微镜观察线粒体结构变化。
4、统计分析:使用GraphPad8.0软件分析数据。所有实验均重复三遍，分析中仅使用平均值±标准差(mean±SD)。用单因素方差分析(ANOVA)确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
1、浓度为40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h，细胞活力下降至(52.34±2.23)％，与对照组比***P＜0.001，建模成功。
2、WB法检测线粒体途径凋亡蛋白结果显示:与Control相比，Aβ25-35组的Cytochromec、Caspase9、Caspase3、Bax表达水平升高(**P＜0.01)，Bcl2表达水平降低(**P＜0.01);而NSC-CPM与NSC-CDM逆转了这些影响，NSC-CDM组优于NSC-CPM组(*P＜0.05)。
3、ROS测定表明，Aβ25-35组的ROS含量明显高于Control组(**P＜0.01)。NSC-CPM或NSC-CDM+Aβ25-35组的ROS含量明显低于Aβ25-35组(**P＜0.01)，NSC-CDM作用优于NSC-CPM(*P＜0.05)。MDA含量测定结果与ROS检测结果相似。与Control组比，Aβ25-35组MMP降低明显(**P＜0.01)，同样，NSC-CPM或NSC-CDM可以逆转这种影响，NSC-CDM作用更优(*P＜0.05)。
4、电镜观察各组线粒体形态:经过Aβ25-35诱导损伤的SH-SY5Y细胞中线粒体肿胀，尤其是线粒体嵴几乎消失或解体。在NSC-CPM及NSC-CDM+Aβ25-35组中，尽管大多数线粒体肿胀，但我们观察到一些正常的线粒体嵴。NSC-CDM+Aβ25-35组的线粒体肿胀比NSC-CPM+Aβ25-35组的线粒体肿胀轻，正常线粒体数量多。
本章小结:
1、以40μM的Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24h建立AD细胞模型。
2、AD细胞模型经神经干细胞条件培养基干预后，线粒体途径凋亡蛋白(Cytochrome c、Caspase 9、Caspase 3、Bax)表达降低，ROS及MDA含量下降，MMP升高，且作用优于神经干细胞完全培养基NSC-CPM，证实神经干细胞条件培养基NSC-CDM(NSCs旁分泌的某些成分)通过线粒体保护作用减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤。
第三部分神经干细胞条件培养基通过PCMT1/MST1途径减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤
研究目的:
神经干细胞是神经元的前体细胞(来源)，而PCMT1是哺乳动物均表达的保守基因，其基本功能为修复衰老蛋白，作用底物众多，参与细胞的基本生命活动，故在神经元分化及修复过程中PCMT1可能起到重要作用。
研究证实PCMT1与MST1在细胞内共定位，PCMT1可能为MST1的上游调控因子，而MST1为经典Hippo凋亡通路的核心蛋白。同时MST1具有抑制自噬、诱导凋亡的多途径作用。
由此我们推测神经干细胞条件培养基可能通过作用于PCMT1/MST1通路对神经细胞凋亡产生调控。本部分实验我们将探讨NSC-CDM是否通过此通路起到细胞保护作用。
研究方法:
第一节
生信分析的方法分析PCMT1在AD患者与正常老年人脑中的表达差异。
①从基因表达数据库GEO下载数据集GSE5281，本数据库包括AD患者与正常老年人海马、内颞叶、后扣带回三个不同脑区基因表达数据，均排除了年龄因素的影响。其中海马区，AD患者10例，正常对照13例;内颞叶区，AD患者16例，正常对照12例;后扣带回，AD患者9例，正常对照13例。
②用Limma包进行差异表达基因分析，分析PCMT1基因是否存在差异表达，差异是否显著。
第二节
1、实验分组如上，四组(①对照组、②A25-35组、③Aβ25-35+NSC-CPM组、④Aβ25-35+NSC-CDM组)培养24h，分别行WB法及实时定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测PCMT1的表达。
2、PCMT1过表达及沉默效率评价与筛选;WB法和qRT-PCR法检测各组PCMT1的表达。
3、正式实验分两大组:
第一组:①正常对照组(Controlcheck，CC组)、②阴性对照组(Negativecontrol，NC组)、③沉默表达PCMT1组(sh-PCMT1组)、④沉默表达PCMT1+NCS-CDM组(sh-PCMT1+NSC-CDM组)。
第二组:①空载质粒组(Vector组)、②过表达PCMT1组(PCMT1-OV组)、③Aβ25-35(40μM，24h)+空载质粒组(Aβ25-35组)、④过表达PCMT1+A25-35(40μM,24h)组(Aβ25-35+PCMT1-OV组)。
5、两大组分别检测:①CCK-8测定法检测细胞活力、②TUNNEL染色法检测细胞凋亡、③WB法检测凋亡相关蛋白含量、④WB法检测PCMT1、总MST1(T-MST1)、磷酸化MST1(p-MST1)表达量。
6、统计分析:使用GraphPad8.0软件分析数据。用单因素方差分析确定实验组之间是否存在显著差异，将*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001视为显著性水平。
结果:
第一节
1、海马区，年龄因素:Control(79.62±2.61)vs.AD(77.80±1.81)，P=0.424，无统计学差异;内颞叶区，年龄因素Control(80.08±2.82)vs.AD(79.13±1.59)，P=0.780，无统计学差异;后扣带回，年龄因素Control(79.77±2.61)vs.AD(77.00±1.89)，P=0.210，无统计学差异。
2、利用Limma对从GEO数据库下载的GSE5281数据集的差异基因分析发现在AD患者与正常老年人的hippocampus、medialtemporalgyrus和posteriorcingulate三个脑区，PCMT1均呈现显著的表达下降***P＜0.001。
第二节
1、WB结果显示:与Control组相比，Aβ25-35组的PCMT1表达水平下降(***P＜0.001);与Aβ25-35组相比，NSC-CDM组PCMT1表达明显上调(**P＜0.01)，高于NSC-CPM组。qRT-PCR法检测结果有相同趋势。
2、质粒转染效率评价与筛选:与NC组相比，sh-PCMT1组PCMT1的mRNA和蛋白表达明显降低(**P＜0.01);与Vector组相比，PCMT1-OV组PCMT1的mRNA和蛋白表达明显增加(***P＜0.001)。构建转染质粒效果良好。
3、CCK-8结果显示:sh-PCMT1组与NC组相比，SH-SY5Y细胞活力下降(**P＜0.01)，PCMT1-OV组较Vector组有更高的细胞活力(*P＜0.05);与Aβ25-35+Vector组比，Aβ25-35+PCMT1-OV组细胞活力明显升高(**P＜0.01)，表明过表达PCMT1逆转了Aβ25-35抑制细胞活力的作用。TUNEL染色结果显示，sh-PCMT1组较NC组凋亡细胞数量增加(**P＜0.01)，PCMT1的过表达逆转了Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞的凋亡作用(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)。
4、WB结果显示:与NC相比，sh-PCMT1组Bcl2/BAX显著下降(**P＜0.01)、Cleavedcaspase3/Caspase3显著升高(*P＜0.05);Aβ25-35诱导损伤后，Bcl2/BAX显著下降(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01)，Cleavedcaspase3/Caspase3显著升高(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01);再经PCMT1过表达处理，Bcl2/BAX下降趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)，Cleavedcaspase3/Caspase3升高趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vs.Aβ25-35+PCMT1-OV组，**P＜0.01)。
5、WB结果显示:沉默PCMT1，PCMT1的表达水平显著降低(NC组vs.sh-PCMT1组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1升高(NC组vs.sh-PCMT1组，**P＜0.01);过表达PCMT1，PCMT1表达升高(PCMT1-OV组vs.Vector组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1下降(PCMT1-OV组vs.Vector组，**P＜0.01);Aβ25-35诱导损伤后，PCMT1的表达水平显著降低(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01)，p-MST1/T-MST1升高(Aβ25-35+Vector组vs.Vector组，**P＜0.01);再经PCMT1过表达处理，p-MST1/T-MST1升高趋势被逆转(Aβ25-35+Vector组vS.Aβ25-35+PCMT1-OV组，*P＜0.05)。
本章小结:
1、生信分析结果表明，与正常老年人相比，AD患者海马、内颞叶、后扣带回三个脑区PCMT1基因显著下调。
2、与对照相比，AD细胞模型PCMT1表达显著下降。
3、AD细胞模型经NSC-CDM干预后，PCMT1下降趋势被逆转，证实NSC-CDM可上调AD细胞模型的PCMT1表达。
4、①与阴性对照比，沉默PCMT1后，细胞活力下降，细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白表达上调;②与质粒空载组比，过表达PCMT1，细胞活力升高，凋亡相关蛋白表达下降;③与质粒空载组比，Aβ25-35损伤细胞后，细胞活力下降，细胞凋亡增加，凋亡相关蛋白表达上调;④与Aβ25-35损伤组比，过表达PCMT1后，细胞活力升高，细胞凋亡减少，凋亡相关蛋白表达下降。以上结果证明，PCMT1调控细胞凋亡，上调PCMT1可减少Aβ25-35诱导的细胞凋亡。
5、①与阴性对照比，沉默PCMT1后，MST1磷酸化上调;②与质粒空载组比，过表达PCMT1，MST1磷酸化降低;③与质粒空载组比，Aβ25-35损伤细胞后，MST1磷酸化上调;④与Aβ25-35损伤组比，过表达PCMT1后，MST1磷酸化降低。以上结果证明，PCMT1调控MST1磷酸化，上调PCMT1可抑制Aβ25-35诱导的MST1磷酸化。
综上所述，神经干细胞条件培养基NSC-CDM上调PCMT1表达;PCMT1具有抑制细胞凋亡的作用;PCMT1具有抑制MST1磷酸化(活化)的作用。即神经干细胞条件培养基上调PCMT1表达，通过抑制MST1活化，作用于经典Hippo凋亡通路，减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
结论
结合研究背景，我们围绕神经干细胞条件培养基是否具有多途径神经保护作用设计并实施了相应的实验，取得以下成果:
1、我们发现Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞损伤具有时间及浓度依赖，建模条件为40μMAβ25-35作用24h，此条件下，细胞活力下降至(56.62±1.26)％。
2、我们应用CCK8检测法、TUNEL染色法、流式细胞仪检测三种方法证实神经干细胞条件培养基具有减少Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的作用。
3、我们应用WB检测线粒体途径凋亡蛋白、电镜观察线粒体结构、流式检测线粒体膜电位等方法证实神经干细胞条件培养基维持线粒体结构及功能的完整性，通过线粒体保护作用减轻Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤。
4、用生信分析的方法对阿尔茨海默病患者与正常老年人相同脑区神经元细胞进行基因差异表达分析发现，PCMT1基因在AD患者三个脑区中的表达均显著下调。
5、应用质粒转染的方法沉默与过表达PCMT1基因，发现PCMT1具有调控SH-SY5Y细胞生存的作用:沉默PCMT1，细胞活力下降，凋亡增加;过表达PCMT1，细胞活力升高。PCMT1具有调控MST1磷酸化(活化)的作用:沉默PCMT1，MST1磷酸化增强;过表达PCMT1，MST1磷酸化下降。
6、我们发现神经干细胞条件培养基能逆转Aβ25-35诱导的PCMT1表达下调;过表达PCMT1能逆转Aβ25-35诱导的MST1磷酸化增强。证明神经干细胞条件培养基通过上调PCMT1表达，抑制MST1磷酸化，作用于Hippo通路，减少Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。
综上所述，实验证实神经干细胞条件培养基通过多途径(“一点多靶”)保护机制减轻Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的损伤。这为神经干细胞条件培养基的临床转化提供了理论支持。