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本研究以奶牛乳腺细胞和组织为模型,研究必需氨基酸比例(Lys与Thr, His和Val的比例)对乳蛋白和乳脂肪合成的影响及其调节机制,为定向调控乳蛋白和乳脂肪合成,改善乳品质提供理论基础。1、氨基酸配比对奶牛乳腺合成乳蛋白的影响1.1氨基酸配比对奶牛乳腺合成乳蛋白的影响为了研究氨基酸配比对mTOR信号通路和奶牛乳腺合成乳蛋白的影响。本试验采用qPCR和Western-blot方法,测定了乳蛋白合成信号通路相关基因在转录和翻译水平的表达情况。试验处理为：1)最优氨基酸比例(OPAA; Lys:Met 2.9:1; Thr:Phe,1.05:1; Lys:Thr,1.8:1; Lys:His,2.38:1; Lys:Val,1.23:1)加mTOR抑制剂雷帕霉素组(OPAARMC,对照)；2) OPAA; 3) 2.1:1 Lys:Thr (LT2.1);4) 1.3:1 Lys:Thr (LT1.3); 5) 3.05:1 Lys:His(LH3.0); 6) 1.62:1 Lys:Val (LV1.6)。乳腺细胞在以上处理中孵育12h。OPAA组上调了SLC1A5, SLC7A5, RPS6KB1的基因表达,下调了IRS1, AKT3, TSC2, EEF1A1和EEF2的基因表达。LT2.1,LT1.3和LH3.0组均增加了SLC1A5, SLC7A5, SLC2A1, SLC2A8, STAT5B和RPS6KB1的基因表达,并减少了TSC2和EEF1A1的表达。LV1.6组与LT2.1, LT1.3和LH3.0组对SLC1A5, SLC7A5, SLC2A1, SLC2A8, STAT5B和RPS6KB1的基因表达具有相似的影响。此外,LV1.6组与OPAA和OPAARMC组相比,显著增加了mTOR的基因表达。然而,与OPAA组和OPAARMC组相比,LV1.6组上调了TSC1和TSC2,下调了EIF4EBP1的基因表达。与OPAARMC组相比,OPAA和LT1.3组增加了mTOR和S6K1的磷酸化。OPAA, LT1.3, LT2.1, LH3.0,和LV1.6组均显著增加了rpS6的磷酸化。并且,OPAA组显著增加了p-酪蛋白的表达,磷酸化的mTOR, S6K1和rpS6与p-酪蛋白具有显著的正相关。因此,OPAA组能够通过mTOR信号通路促进乳蛋白的合成。1.2 mTOR信号通路在氨基酸介导的乳蛋白合成中的作用研究为了深入研究必需氨基酸对乳蛋白合成信号通路的调节机制,本试验检测了无必需氨基酸,添加必需氨基酸和苏氨酸对mTOR和乳蛋白的表达调控,以及无必需氨基酸,添加必需氨基酸和苏氨酸情况下对S6K1,4EBP1表达的影响。结果表明,添加必需氨基酸能显著增加mTOR和β-酪蛋白的表达,并且S6K1和4EBP1的表达也显著增加。进一步添加mTOR的抑制剂雷帕霉素或者通过mTOR siRNA的方法抑制mTOR的活性,检测其对β-酪蛋白,S6K1,4EBP1表达的影响。结果显示,抑制mTOR活性,无必需氨基酸,添加必需氨基酸组β-酪蛋白表达显著下降,且S6K1,4EBP1的表达也显著降低。因此,必需氨基酸可以通过激活mTOR信号通路的方式促进乳蛋白的合成,在此过程中,S6K1,4EBP1是mTOR的直接作用效应元件。2、氨基酸配比对奶牛乳腺合成乳脂肪的影响2.1氨基酸配比对奶牛乳腺合成乳脂肪的影响为了研究氨基酸配比对奶牛乳腺合成乳脂肪的影响。本试验采用qPCR和Western-blot方法,测定了乳脂肪合成信号通路相关基因在转录水平的表达情况。试验处理为：1)最优氨基酸比例(OPAA; Lys:Met 2.9:1; Thr:Phe,1.05:1; Lys:Thr, 1.8:1; Lys:His,2.38:1; Lys:Val,1.23:1)加mTOR抑制剂雷帕霉素组(OPAARMC,对照)；2) OPAA; 3) 2.1:1 Lys:Thr(LT2.1); 4) 1.3:1 Lys:Thr(LT1.3); 5) 3.05:1 Lys:His(LH3.0); 6) 1.62:1 Lys:Val (LV1.6)。乳腺细胞在以上处理中孵育12h。与OPAARMC组相比,LT2.1,LT1.3,LH3.0和LV1.6组显著上调了ACSS2,FABP3, ACACA, FASN, SCD, LPIN1, INSIG1, SREBF1, PPARD和NR1H3的mRNA表达水平。LV1.6组显著上调了ACSL1, DGAT1, RXRA,下调了PPARG的mRNA表达水平。尽管OPAA组对PPARG没有显著的影响,但是OPAA组显著增加了ACSS2, FABP3, ACACA, FASN, SCD, LPIN1, INSIG1,和SREBF1的mRNA表达。基因网络分析结果表明,必需氨基酸比例可能通过SREBF1和PPARG调节乳脂肪的合成。因此,必需氨基酸在促进脂肪基因网络调节乳脂肪合成方面具有重要作用。2.2. mTOR调节氨基酸介导的乳脂肪合成信号通路。前期试验发现必需氨基酸可以影响乳脂肪合成信号通路的基因网络,为了揭示必需氨基酸对乳蛋白合成信号通路的调节机制,本试验检测了无必需氨基酸,添加必需氨基酸和苏氨酸对SREBP1和PPARG的表达调控,以及无必需氨基酸,添加必需氨基酸和苏氨酸情况下对脂肪酸从头合成和转运相关基因(ACACA, FASN, FABP3)和甘油三酯合成相关基因LPDSf1表达的影响。结果显示,添加必需氨基酸能显著增加转录调节因子SREBP1和PPARG的表达,以及脂肪酸从头合成关键酶(ACACA和FASN),脂肪酸转运蛋白FABP3,以及甘油三酯合成相关酶LPIN1的mRNA丰度。在必需氨基酸添加的基础上,抑制mTOR的活性,可以显著降低PPARG和SREBP1的表达,同时,也可显著降低ACACA, FASN, FABP3和LPIN1的表达。因此,必需氨基酸可以通过激活mTOR信号通路的方式促进转录调节因子SREBP1和PPARG的表达,在此过程中, ACACA, FASN, FABP3和LPIN1可能是mTOR的间接作用效应元件。表明必需氨基酸可能通过mTOR调节SREBP1,进而在脂肪酸或甘油三酯合成中发挥作用。综上所述,最优比例的必需氨基酸添加可显著促进乳蛋白的合成。在奶牛乳腺合成β-酪蛋白过程中,最优比例的必需氨基酸除自身作为底物参与乳蛋白合成外,可能还通过促进mTOR的磷酸化,激活mTOR信号通路发挥作用。此外,最优比例的必需氨基酸激活：mTOR后,可通过mTOR-SREBP1的调节作用,在脂肪酸和甘油三酯合成过程中起到重要作用。