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研究背景: 哺乳动物精子具有结合转运外源DNA的能力，精子介导基因转移(sperm-mediated gene transfer，SMGT)是一种简便、高效的生产转基因动物的方法。但该方法极大的随机性与不确定性成了SMGT广泛运用和推广的障碍，主要问题是对精子结合转运外源DNA的机理不明确。目前研究较少，且主要集中在精子膜CD4分子内化外源DNA上。CD4是精子质膜上的受体和转运候选分子之一，是一种单链跨膜蛋白，SMGT方法创始人Lavitrano教授和我们组前期研究都证实CD4分子在精子内化转运外源DNA的过程中发挥重要作用。但封闭CD4分子的精子仍部分具有转运外源DNA的能力，说明精子结合转运外源DNA不仅有CD4发挥作用，而是多个分子共同作用的结果。且蛋白质相互作用在生命活动中扮演关键角色，所以筛选鉴定与CD4相互作用、且在精子结合转运外源DNA中的重要分子，将为精子介导基因转移机理的研究开辟新的思路，最终为建立简单、稳定、高效的精子介导转基因方法学奠定基础。 材料与方法: 本研究首先构建了诱饵载体pGB-mCD4，对其自激活效应进行检测。具体方法是:提取小鼠睾丸组织mRNA，通过RT-PCR获得mCD4基因片段，将mCD4与pGB质粒载体连接构建，阳性克隆进行质粒提取测序，对阳性克隆载体进行自激活检测。接着，利用酵母双杂交系统，采用转化法对小鼠睾丸cDNA文库进行筛选，对阳性克隆进行基因测序，序列分别利用GenBank比对，筛选与CD4相互作用的基因，并对其进行初步的生物信息学分析。最后，检测mCD4和4种候选分子在哺乳动物293FT细胞中的共表达情况。具体方法是:构建真核表达载体 pCDEF-Myc-mCD4, pCDEF-FLAG-BSPRY, pCDEF-FLAG-RANBP9pCDEF-FLAG-CD320， pCDEF-FLAG-Creld2，将构建的载体转化至293FT细胞，转染48h，在荧光显微镜和FACS确认转染效率。对细胞裂解物进行了Western blot验证。 结果: (1)构建了诱饵载体pGB-mCD4，mCD4的长度为123bp，经电泳、测序检测为目的片段;诱饵载体转入Y190菌株，经β-galactosidase显色，表明pGB-mCD4不能自激活酵母细胞Y190。(2)睾丸cDNA文库的转库效率为9.3×105cfu/μg。转化酵母Y190后培养，有199个克隆在Leu-Trp-His-/SD+3AT培养基平板上生长，随后进行β-galactosidase显色反应分析，有26个克隆经过显色后变蓝，认定为阳性克隆。将26个酵母质粒转化细菌感受态后，在LB+Ampr平板中生长，再挑单克隆扩增细菌质粒。将得到的26个克隆细菌质粒与质粒pGB-mCD4质粒两两共转Y190酵母菌，随后再β-galactosidase显色反应分析，23个样品变蓝，分别将23条基因测序，利用GenBank进行比对，得到的8条阳性基因，分别为:BSPRY(登录号:NM_138653.1)、Pmpcb(登录号:NM_028431.2)、RANBP9(登录号:NM_019930.2)、Morc2b(登录号:NM_177719.4)、Ggnbp2(登录号:NM_153144.2)、CD320(登录号:NM_019421.3)、Adam2(登录号:NM_009618.2)和Creld2(登录号:NM_029720.2)。(3)构建了真核表达载体pCDEF-Myc-mCD4，pCDEF-FLAG-BSPRY, pCDEF-FLAG-RANBP9, pCDEF-FLAG-CD320和口pCDEF-FLAG-Creld2，将构建的质粒载体共转化至293FT细胞，转染效率为97.7％。经Western blot验证，其中BSPRY基因和RANBP9基因可以在细胞中稳定表达。 结论: 利用酵母双杂交，筛选到8个小鼠CD4相互作用分子。