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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引发猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)。该病急性接触传染病,主要症状是仔猪黄色水样腹泻、呕吐和脱水。PEDV毒株的ORF3基因负责编码一种离子通道蛋白,与病毒毒性大小有重要关系;M基因负责编码一种跨膜蛋白,对病毒的组装和出芽有重要意义;N基因负责编码核衣壳蛋白,对形成核衣壳具有重要作用。为了解安徽省PEDV的流行和遗传进化情况,作者收集2013年2月-2013年4月爆发PED猪场病死仔猪的十二指肠、空肠、肠系膜淋巴结等作为样品进行PEDV的分离和鉴定,以本实验室保存的PEDV阳性病料作为阳性对照,分离鉴定出6株PEDV毒株后,对其ORF3基因、M基因、N基因进行遗传进化分析。作者采用Trizol法提取RNA,TAKARA公司反转录试剂盒转录CDNA并于-20℃保存备用。用Oligo7.0参考CV777标准毒株(AF353511.1)序列设计本研究所需的特异性引物。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察或拍照。样品病料PCR检测,设计的特异性引物覆盖M基因全段,片段大小为412bp,电泳条带与阳性对照的大小相当,阴性对照未出现任何条带,确定6个地方的病料中存在PEDV毒株。Vero细胞培养至50代后,将过滤除菌后病料溶液接种到Vero细胞,第22代细胞在48h出现肉眼可见CEP。41代时接毒细胞发生规律性病变,且每次时间在缩短:细胞在24h就出现细胞肿胀、破裂、脱落;36h后细胞开始大量脱落,细胞间隙比之前增大;48h后细胞脱落达90%,细胞呈梭形,互相之间拉伸成网状;而阴性对照细胞病变速度缓慢、病变率较小。此后用SYBR Green I实时荧光定量PCR和传统PCR对分离的PEDV毒株进行鉴定,特异性引物针对M基因,片段大小为299bp。所建PEDV标准曲线符合实验预测效果并且具有良好线性关系:相关系数为0.999,扩增效率为1.03;敏感性试验中检测到的最低的质粒浓度是12.1 copies/μL,是常规PCR检测到的数值的100倍。重复性试验Ct值的变异系数是0.12%-0.56%,组间变异系数是0.65%-2.33%,表明这个实验具有良好的稳定性和重复性。将得到的PCR产物回收纯化后送出测序,进行序列分析发现与PEDV M基因的同源性为99.9%,确认分离的6株毒株为PEDV,并分别命名为AH1301、AH1302、AH1303、AH1304、AH1305、AH1306。6株PEDV分离株的ORF3、M、N基因的PCR检测所设计的特异性引物均覆盖ORF3、M、N基因,片段大小分别为705bp、715bp、1442bp;PCR产物回收后分别连接pMD18-T上进行转化和克隆,得到阳性重组质粒送出测序。序列分析显示:6个安徽PEDV毒株的ORF3全长675bp,编码224个氨基酸;6个M全长681bp,编码226个氨基酸;6个N全长1326bp,编码441个氨基酸。6个毒株ORF3蛋白均比attenuated DR13弱毒株多17个氨基酸。与CV777标准株相比,有2个ORF3分别出现了1个新变异氨基酸;6个M基因除AH1304外均在第13氨基酸位点出现E→Q突变;6个N的核苷酸与氨基酸均未出现片段的增多或者缺失的现象。同源性分析显示:ORF3、M、N基因与参考毒株的核苷酸序列同源性分别为98.8%-100%、97.5%-100%、96.2%-99.7%;氨基酸同源性分别为99.6%-100%、97.8%-100%、97.3%-100%。遗传进化树表明:6个毒株的ORF3基因、M基因和N基因与参考毒株均可分成3个群:其中AH1304株与弱毒株SD-M和attenuanted DR13亲缘性最近,剩下的5株安徽毒株与2013年美国流行毒株IA1和2012年中国流行毒株AH2012亲缘关系更近;6株PEDV毒株均与CV777标准毒株、中国LZC毒株亲缘关系较远。