目的双酚A是一种常见的环境内分泌干扰物,有研究表明BPA可通过活化T细胞核因子(NFAT)影响巨噬细胞细胞因子的释放。NFAT广泛存在于各类细胞中,是一类具有重要生理功能的转录因子,对细胞因子的转录和表达具有调控作用。白细胞介素-10(IL-10)是免疫细胞中最有效的抗炎因子,其分泌量的降低,可使炎症因子的分泌量增多,引发炎症反应。本研究以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)为靶细胞,采用不同剂量的脂多糖(LPS)作为激活剂,从Ca2+/CaN及Raf/MEK/ERK两条信号通路,去研究NFAT在双酚A(BPA)调控巨噬细胞分泌IL-10中的作用,为进一步研究BPA的免疫毒作用机制提供理论依据。方法以 1、2、5μg/ml LPS 为激活剂,1、10、100、1000μmol/L BPA 作用于 RAW264.7细胞4h、12h、24h,CCK-8试剂盒检测细胞活性;1、10、100μmol/LBPA作用细胞24h,ELISA试剂盒检测细胞上清液中CaN、IL-10蛋白含量,在2、5μg/ml LPS为激活剂条件下,加入Ca2+阻断剂异搏定(Verapamil,Ver)(10、30μmol/L)、CaN/NFAT 阻断剂他克莫司(Tacrolimus,FK506)(0.25、0.5μmol/L)、ERK1/2 阻断剂 PD98059(10、40μmol/L)分别测定 100μmol/L BPA 作用 下 CaN、IL-10 蛋白含量;以 2、5μg/mlLPS 为激活剂,1、10、100μmol/LBPA 作用细胞 4h、12h测定 IL-10、NFATp、NFATc、PPP3r1、ERK1/2、MEK、RafA/CmRNA 表达,加入阻断剂 Ver、FK506、PD98059 后测定 IL-10、NFATp、NFATc、PPP3r1、ERK1/2的基因表达。2、5μg/mlLPS为激活剂,100μmol/LBPA及阻断剂Ver、FK506作用细胞24h,Western Blot测定蛋白表达。结果1.与1、2、5μg/mlLps激活剂组比较,BPA浓度为1、10、100μmol/L时,染毒4h、12h及24h对细胞活性无明显影响,而BPA浓度为1OO0μmol/L时对RAW264.7细胞活性存在明显抑制作用(P<0.01)。2.BPA 1、10、100μmol/L 作用 RAW264.7 细胞 4h,与 2、5μg/ml LPS 组比较,100μmol/L BPA 可使 IL-10 mRNA 水平降低(P<0.05);BPA 作用 RAW264.7 细胞12h,与 2、5μg/ml LPS 组比较,100μmol/L BPA 可使 IL-10 mRNA 水平降低(P<0.01)。100μmol/LBPA 加入阻断剂 Ver、FK506、PD98059 后染毒 4h、12h 与100μmol/L BPA染毒组比较,Ca2+阻断剂Ver可使IL-10 mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);相同实验条件下0.25、0.5μmol/LCaN/NFAT阻断剂FK506,使IL-10基因表达水平升高(P<0.05);与100μmol/LBPA染毒组比较10、40μmol/L PD98059使IL-10mRNA表达水平降低(P<0.05)。与2、5μg/mlLPS激活剂组比较,BPA浓度为100μmol/L时可抑制IL-10蛋白的分泌,且差异均有统计学意义(P<0.05),100μmol/L BPA 加入阻断剂 Ver(10,30μmol/L)、FK506(0.25,0.5μmol/L)、PD98059(10,40μmol/L)与 100μmol/L BPA 组比较,Ver、Fk506 使 IL-10 分泌量增加,而PD98059仍使IL-10蛋白分泌量降低。3.与对照组比较,2、5μg/ml LPS可使NFATp、c基因表达升高。1、10、100μmo 1/L BPA 作用 RAW264.7 细胞 4h、12h,与 2、5μg/ml LPS 组比较,100μmol/L BPA 可使NFATp/c基因表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,2μg/ml LPS可使细胞核内NFATp、NFATc蛋白表达升高,100μmol/L BPA作用RAW264.7细胞24h对NFATp、NFATc蛋白表达影响不明显,5μg/mlLPS可使细胞核内NFATp、NFATc蛋白表达升高,100μmol/L BPA作用RAW264.7细胞24h使NFATp、NFATc蛋白表达降低。100μmol/LBPA 加入阻断剂 Ver、FK506、PD98059 后染毒 4h、12h,与100μmol/L BPA染毒组比较阻断剂Ver可使NFATp/c mRNA表达水平降低;相同实验条件下 0.25、0.5μmol/L阻断剂FK506,使NFATp/c mRNA表达水平降低(P<0.05);与 100μmol/L BPA 染毒组比较 10、40μmol/L PD98059 使 NFATc mRNA表达水平降低,NFATpmRNA表达水平升高(P<0.05)。LPS2μg/ml,100μmol/L BPA加入阻断剂Ver、FK506后染毒24h与100μmol/L BPA染毒组比较,阻断剂Ver、FK506各剂量使NFATp、NFATc蛋白表达降低。4.100μmol/LBPA 作用 RAW264.7 细胞 4h、12h,与 LPS 组比较,PPP3r1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与对照组比较,1、2、5μg/ml LPS均可激活RAW264.7分泌功能,使CaN蛋白分泌量明显增高,100μmol/LBPA加入10、30μmol/L阻断剂Ver染毒4h,12h,与100μmol/LBPA比较,使PPP3R1 mRNA表达水平明显降低。与各激活剂组比较,BPA浓度为1OOμmol/L使CaN蛋白分泌量明显增高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。100μmol/L BPA加入阻断剂组Ver(10,30μmol/L),与 100μmol/LBPA 组比较,Ver 使 CaN 表达量明显降低(P<0.05)。5.与 2、5μg/ml 激活剂组比较,当 LPS 为 2μg/ml 时 1-100μmol/L BPA 作用 4h、12h对RafA基因表达无明显作用(P>0.05),当LPS为5μg/ml时100μmol/LBPA,染毒4h,12h使RafA的mRNA水平升高(P<0.05);RafC、MEK在各时间点,各激活剂剂量下,BPA浓度为10μmol/L时就可观察到基因表达升高(除2μg/ml LPS,染毒 4h,RafC、MEKmRNA 表达水平在 100μmol/L 明显升高)(P<0.05)。与2、5μg/ml激活剂组比较,100μmol/L BPA作用4h,12h可使ERK1/2表达水平升高(P<0.05),加入 10、40μmol/L 阻断剂 PD98059 染毒 4h、12h,与 100μmol/L BPA 比较,10、40μmol/L PD98059 可使 ERK1/2 mRNA 表达水平降低(P<0.05)。结论1.BPA通过抑制NFATp/c细胞核蛋白的含量,可诱导巨噬细胞分泌细胞因子IL-10水平降低。2.NFAT在BPA影响巨噬细胞分泌IL-10中发挥重要作用。3.BPA能促进Raf、MEK及ERK的表达,且ERK抑制剂明显增加NFATp表达同时降低了 NFATc表达而使IL-10含量降低,显示Raf/MEK/ERK参与了 BPA对NFATp/c的调控。