蛋白质与酶在固相介质上的吸附行为以及吸附对其构象,活性的变化研究已经成为近年来生物医学及生物材料等领域的研究热点。生物技术的发展尤其是转基因技术及生物医药工程的发展使得外源活性蛋白进入环境的可能性增大,另一方面采用生物学方法进行环境修复使得酶类等生物大子与环境介质的相互作用研究显得越来越有必要。因此,研究蛋白质与酶在固相表面的行为在环境科学领域同样具有重要意义。本论文以转Bt基因表达的CrylAb杀虫蛋白以及在环境催化中起重要作用的过氧化氢酶作为具有环境生物学效应的活性蛋白和酶类的代表,系统地研究了不同环境固相介质的表面性质(如亲疏水性,表面基团特征,表面孔结构等)对这两种蛋白类物质在构象,活性及稳定性等方面的影响。通过本论文的研究,旨在建立环境生物大分子研究中以活性变化为研究基础的思想和方法,并基本明确固相表面的性质对生物大分子吸附特征,活性及稳定性所产生的影响。本论文第一部份综述了环境科学中研究生物大分子吸附现象的意义及研究进展。论述了蛋白质构象与活性变化的相关性,以及影响蛋白质活性与稳定性的主要因素。重点论述了固相表面吸附对蛋白质构象,稳定性及活性的影响。总结了蛋白质在固相表面吸附的研究方法与研究模型。此外对活性蛋白以及酶类在典型环境固相介质中的吸附与活性变化的相关研究进展进行了综述。本论文第二部分以转Bt基因植物表达的CrylAb蛋白为研究对象,系统地研究了该蛋白从转基因植物中的提取和纯化方法,并首次用从植物中纯化的杀虫蛋白代替微生物表达的蛋白,进行后续的构象变化分析和环境行为研究,以及活性变化与吸附相关性机理研究。第二部份第一章提出了采用生物信息学方法预测蛋白质结构及性质的基础上选择合理的基于不同色谱分离机制的多重色谱组合方法。采用了蛋白质结构分析与预测软件明确了目标蛋白与共存杂蛋白在表面电荷与疏水性上的差异,采用离子交换色谱与疏水作用色谱成功地对含量极低的CrylAb蛋白质进行了分离纯化,所得蛋白满足了后续工作的要求。由于蛋白构象与活性具有显著的相关性,因此必须建立起构象变化分析的方法,本部份第二章根据抗体与蛋白质抗原间的相互作用与蛋白质表面抗原决定簇的折叠状态相关性的原理,采用CrylAb/Ac试剂盒成功地探测了转crylAb基因水稻表达的CrylAb蛋白在不同溶液介质下的热致构象变化行为,以及不同有机溶剂及溶液pH值对该蛋白的构象变化的影响程度。表明ELISA分析值的变化可以很好地反映出蛋白质构象及活性的变化。实验结果与已报道的荧光光谱分析法结果非常吻合。另外,用该法还发现了腐殖酸能在一定时间内保持CrylAb蛋白构象的稳定性。ELISA方法对CrylAb蛋白构象的探测具有灵敏度,选择性高的优点。该方法的建立有助于后续环境行为研究以及建立杀虫活性与蛋白构象间的关系。第三章研究了由转crylAb基因水稻分泌的CrylAb蛋白(Bt-r)在不同类型粘土矿物中的吸附与解吸行为,以及该蛋白被各种单离子饱和的蒙脱土以及高岭土吸附前后的杀虫活性变化及稳定性变化。结果表明,Bt-r均能被蒙脱土和高岭土强烈吸附,并表现出不同的吸附机制,该杀虫蛋白在蒙脱土中主要表现出离子交换作用机制,而在高岭土中,表现出显著的疏水作用机制。其中,高岭土对Bt-r表现出最强的吸附能力,在其它三种单离子饱和的粘土中,吸附能力按Fe3+-蒙脱石>Al3+-蒙脱石>Na+-蒙脱石顺序递减。复合提取液(Na2CO3-NaHCO3+焦磷酸钠+DTT+甘油+Triton X-100)能以60%以上的回收率提取被蒙脱土和高岭土强吸附的CrylAb蛋白。酶联免疫分析(ELISA)和杀虫活性数据表明：在酸性单离子饱和蒙脱土中Bt-r的稳定性和杀虫活性均低于呈碱性的Na+-蒙脱土中。Bt-r在高岭土复合物中的活性显著高于其在蒙脱土中的活性,并且具有较高的稳定性。本部分第四章研究了固相表面的吸附对CrylAb蛋白活性产生影响的机理。采用XRD分析证明了CrylAb蛋白的部分肽链进入蒙脱土层间,其中Na-蒙脱土单离子饱和粘土的层间踞扩增程度大于Fe3+饱和蒙脱土及Al3+饱和蒙脱土,表明CrylAb蛋白肽链中有较多的区域进入Na-蒙脱土层间,FTIR及Lorentzian多曲线拟合的方法初步证明了吸附在该单离子饱和粘土上的蛋白并未发生构象的改变,因此可以推断CrylAb蛋白与Na-蒙脱土复合物杀虫活性的降低极有可能是蛋白结构域Ⅱ中的部分起受体识别与结合作用的氨基酸进入层间。虽然,CrylAb蛋白肽链进入Fe3+饱和蒙脱土及Al3+饱和蒙脱土的程度更小,但其杀虫活性却几乎完全丧失,红外光谱证实了在上述酸性蒙脱土上,与蛋白构象有关的酰胺Ⅰ带几个特征吸收峰发生了显著的改变。因此,CrylAb蛋白在酸性蒙脱土上的活性丢失极有可能是构象变化和活性位点受空间位阻的协同作用。由于环境中的粘土矿物通常与腐殖质形成复合物,因此研究活性蛋白在腐殖质存在下的稳定性和活性变化非常重要,因此本部分第五章研究了CrylAb蛋白在腐殖质存在下的稳定性及活性变化情况。发现该蛋白在腐殖酸存在下杀虫活性较自由态蛋白降低,而在富里酸存在时,该蛋白却能保持极高的稳定性。采用GPC方法初步证明了CrylAb蛋白与富里酸形成了稳定的复合物。但是,富里酸对该蛋白构象保护的机理还有待于进一步探讨。本部份第六章采用FTIR技术,并用光谱信号导数处理方法以及Lorentzian多曲线拟合方法研究了CrylAb蛋白在不同疏水表面所产生的构象变化。研究表明表面疏水性越强,蛋白吸附与解析的可逆程度越低。发现了强疏水表面能导致该蛋白发生构象的变化,进而使活性消失。而该蛋白在弱疏水表面不会产生明显的构象变化,同时也能保持其杀虫活性。由于酶在环境催化中的重要性,因此本论文第三部份研究了具有代表性的过氧化氢酶在固相介质表面的吸附与活性的相关性。第三部分第一章研究了该酶在不同固相介质表面的吸附动力学性质,发现了在膨胀性粘土表面存在外表面的快速吸附动力学过程以及内表面的慢速吸附过程。此外酶在疏水性表面由于酶分子空间取向的调整也存在一个慢速吸附动力学过程。酶在各种固相表面的吸附可逆性随固相性质的不同而异。以离子交换作用机制为主吸附在固相表面的酶较易被一定离子强度的缓冲液解吸,而疏水性表面对酶的吸附可逆性较差,且随固相表面疏水性的增大,吸附会变得越来越不可逆。采用生物信息学手段预测酶的活性中心的表面暴露程度、所处的二级结构、活性中心周围区域的亲疏水性,可以从酶的空间结构预测和解释吸附对酶活性产生的影响。实验结果表明,过氧化氢酶被不同性质的固相表面吸附后,均在不同程度上发生催化活性和稳定性的变化。疏水性界面促使酶的构象改变而使酶的催化活性显著降低,同时稳定性也较差。以静电作用吸附的过氧化氢酶活性及稳定性均保持良好,但有Fe3+等重金属离子存在下,由于多结合位点的形成,一方面使酶的构象发生一定的改变,使得初始活性有一定的降低,但同时这种稍变形的构象被这种多位结点合模式所固定,而使酶的稳定性得到提高。研究结果还表明：固相表面对酶的活性变化产生的影响不仅体现在表面的官能团,亲疏水性的影响,固相表面的微孔结构,包括介孔及纳米,微米级孔对酶的稳定性及催化活性也能产生显著的影响。本部份第二章通过模板聚合法合成了表面多孔性的介孔材料,并用FTIR, XRD及SEM对材料进行了表征。研究表明该材料对过氧化氢酶具有良好的吸附作用,并能保持吸附态酶的高活性及高稳定性。同时能在一定程度上抵抗微生物对酶的降解。该实验证实了表面的多孔性结构对生物大分子的稳定性及活性同样具有显著的影响,该研究对于固定化酶在环境催化领域中的应用具有重要的意义。