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植物生存在复杂多变的环境之中,它们不仅拥有抵御病原菌的天然屏障,如坚硬的细胞壁、质外体中的低pH值、自身分泌的酶或抗菌组分等,而且进化出了精密的先天免疫系统:病原菌相关分子特征(PAMPs)诱导的免疫反应(PTI)和效应因子诱导的免疫反应(ETI)。PTI和ETI,是植物先天免疫的两个不同层面,但两者密切相关,如它们的受体通常以复合物的形式出现、共享着某些共同的下游信号组分等。植物病原细菌通过Ⅲ型分泌系统分泌大量效应蛋白进入植物细胞,操控植物细胞功能并引起植物病害。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是一种革兰氏阴性细菌,能够在世界范围内引起十字花科植物的黑腐病,包括白菜、甘蓝以及模式植物拟南芥。随着Xcc 8004菌株基因组测序工作的完成,拟南芥-Xcc模式系统越来越成为研究植物-病原细菌互作的有效工具。本研究构建了多个基因敲除的单突变体和多突变体菌株,并在十字花科植物中进行了致病性分析。重点研究了效应蛋白XopLXcc8004和XopQXcc8004在拟南芥中的作用,试图阐明这些效应蛋白的生物学功能,为Xcc 8004致病机理的研究提供线索。本文的主要研究结果如下:1.利用三亲接合法,构建了多个单基因敲除和多基因敲除的突变体菌株,包括Xcc 8004△xcopQ,Xcc 8004△xopL,Xcc 8004△avrBS1,Xcc 8004△avrAC等,并进行 了致病性分析,结果显示单突变体菌株在甘蓝上的致病力均有不同程度的下降,而多突变体菌株在甘蓝上造成致病力变化的多样化。这些突变体菌株在拟南芥上的致病性表型不明显。结果表明,某些基因是Xcc 8004在甘蓝上发挥完全毒性所必需的,且各基因之间存在一定的相互影响,通过基因敲除的方法检测这些基因对致病性的影响,可以为阐明各基因的功能提供重要线索。2.通过生物信息学分析,基因XC4273编码蛋白XopLXcc8004,含有多个亮氨酸重复序列;基因XC3177编码蛋白XopQXcc8004,含有类核苷酸水解酶结构域。两个蛋白均为保守蛋白,在多个植物病原菌中均含有同源蛋白。3.通过荧光定量PCR分析了基因XC4273和XC3177在Xcc 8004△hrpG和Xcc 8004△hrpX突变体中的表达情况及在结构基因突变体Xcc 8004△hrcV中的分泌情况。结果显示两个基因都是受HrpG和HrpX蛋白的正调控,且它们的蛋白分泌都是依赖于结构基因hrcV。这说明XopLXcc8004和XopQXcc8004都是Xcc 8004的Ⅲ型分泌系统效应蛋白。4.利用荧光素酶双报告系统研究发现在细菌鞭毛蛋白flg22诱导下,XopLXcc8004和XopQXcc8004蛋白均能抑制拟南芥原生质体中PTI标志基因FRK1::LUC的相对表达量,说明两个蛋白均可以抑制植物PTI途径。5.利用农杆菌介导的花序浸渍法获取了 XopLXcc8004和XopQXcc8004的拟南芥转基因植株,细菌接种实验显示两个蛋白都能够促进Xcc 8004在拟南芥叶肉细胞中的生长。XopLXcc8004蛋白在拟南芥中过量表达会导致植物幼苗生长受抑制;XopQXcc8004蛋白在农杆菌中过量表达引起本氏烟草的超敏反应,在拟南芥中过量表达也会导致植物接种高浓度的Xcc8004后产生超敏反应。这些结果表明,两个蛋白在拟南芥中都发挥毒性作用,且XopQXc8004可能激活植物的ETI途径。6.XopLXc8004和XopQXcc8004均能抑制flg22诱导的ROS爆发、胼胝质沉积以及包括PR1基因在内的植物防御相关基因的表达;XopQXcc8004能够抑制flg22诱导的MAPK激活,而XopLXcc8004不能抑制MAPK。这些结果表明,XopLXcc8004和XopQXcc8004均能抑制植物的PTI途径,且XopQXcc8004抑制PTI可能与MAPK途径有关。7.共聚焦显微镜观察显示XopQXcc8004蛋白定位于拟南芥原生质体和烟草下表皮细胞的细胞膜,而XopLxcc8004没有显示出亚细胞定位的特殊性,在细胞膜、细胞质和细胞核均有分布。8.利用免疫沉淀及银染,Mate&plate Libraries文库和酵母双杂交系统筛选到了可能与XopQXcc8004蛋白互作的蛋白。本研究为细菌效应蛋白如何调控植物先天免疫提供了新的线索,将有助于我们深入理解细菌致病机理和植物免疫应答。