背景:随意皮瓣在整形重建手术中被广泛用于修复皮肤软组织缺损,但皮瓣的坏死目前仍是一个未能得到很好解决的问题。诸如抗交感药、血管扩张剂、钙通道阻滞剂、前列腺素抑制剂、糖皮质激素和自由基清除剂等均被报道能增加皮瓣成活率[1,2]。但这些药物不能防止皮瓣的完全坏死。同时,大部分药物要取得满意的效果的话都需要大剂量的全身用药,这样就会引起许多副作用的发生。已有研究显示天然水蛭素在动物实验中能增加皮瓣成活率。其机制可能是通过改善微循环和抗氧化作用。然而水蛭素对皮瓣缺血和淤血后的炎症反应、细胞凋亡能否有影响还未见报道。本研究的目的是检测水蛭素对大鼠随意皮瓣炎症反应及细胞凋亡的作用,并探讨可能的发生机制。第一部分大鼠背部皮瓣实验模型的建立目的:建立大鼠背部超长随意皮瓣模型,观察术后皮瓣组织的淤血坏死情况及天然水蛭素皮下注射对超长随意皮瓣术后成活率的影响。方法:48只健康级SD大鼠,雌雄不限,体重250-300g,随机分成两组,每组24只,建立随意皮瓣血运障碍的动物模型。H组皮瓣皮下局部注射天然水蛭素(6ATU/次,1次/12小时),C组在与H组相同的时间点于皮瓣皮下局部注射相同容积生理盐水,作为对照组。术后连续观察并记录大鼠背部皮瓣情况,并于术后第7天计算皮瓣的成活率。结果:天然水蛭素皮下注射治疗组(H组)皮瓣存活表面积为23.56±0.84cm2,皮瓣存活率为78.54±2.80%;生理盐水皮下注射对照组(C组)皮瓣存活表面积为19.39±0.96cm2,皮瓣存活率为64.62±3.20%。两组之间成活面积和成活率比较均具有显著性差异(P<0.05)。结论:超长随意皮瓣术后远端会发生淤血坏死,天然水蛭素皮下注射能减少超长随意皮瓣术后淤血坏死,提高皮瓣的成活率。第二部分水蛭素通过p38 MAPK/IKK/NF-κB通路影响术后淤血皮瓣中IL-6、TNFα及ICAM-1的表达目的:观察大鼠背部超长皮瓣术后皮瓣局部炎症反应的情况及天然水蛭素皮下注射对皮瓣中IL-6、TNFα及ICAM-1表达的影响。并探讨可能的作用机制。方法:第一部分中的实验大鼠在术后即刻和术后第1、2、4、7天采集背部皮瓣组织标本。制备组织切片,采用苏木素-伊红染色(HE染色)方法检测皮瓣中炎症介质在组织的浸润情况;制备组织匀浆提取总蛋白后,采用免疫印迹法(Western blot)检测皮瓣组织中炎症相关细胞因子的表达情况。结果:(1)HE染色:在正常皮瓣组织中,可见表皮及皮下组织结构正常,组织间隙偶有少量中性粒细胞散在分布,胞浆呈淡红色或淡紫色,核多为圆形,呈深蓝色或紫色。C组大鼠皮瓣组织随着术后时间的延长,皮瓣组织有水肿发生,炎性渗出逐渐增多,到第4天时已有大量中性粒细胞聚集、浸润。H组大鼠皮瓣组织术后几天中也有炎性渗出及中性粒细胞聚集,但数量较少。(2)IL-6含量:C组在术后第2天到第7天显著上升(p<0.05 vs.day0)。但H组术后并没有明显升高,且低于C组(p<0.05)。(3)TNFα含量:术后C组显著升高(p<0.05 vs.day 0),并在第4天达到峰值。H组也显著升高(p<0.05 vs.day 0),但低于C组(p<0.05)。(4)ICAM-1含量:C组ICAM-1含量和TNFα含量有着相似的变化趋势。但H组ICAM-1含量没有明显的增加,且低于C组(p<0.05)。(5)pp38 MAPK/p38 MAPK:C组术后明显增加(p<0.05 vs.day 0),在术后第4天达到峰值。H组和C组有相同的变化趋势,但低于C组(p<0.05)。(6)IKK含量:C组术后第1天到第7天均显著升高(p<0.05 vs.day0);H组术后较术前无明显变化。术后第1天到第7天,H组都低于C组(p<0.05)。(7)p NF-κB/NF-κB:C组术后第1天开始显著上升(p<0.05 vs.day 0)。H组术后第2和第4天显著升高(p<0.05 vs.day 0),但在术后第7天时恢复到与术前相近的水平。术后H组p NF-κB/NF-κB值低于C组(p<0.05)。结论:(1)超长随意皮瓣术后有炎症反应发生,其机制可能为凝血酶通过PARs/p38 MAPK/IKK/NF-κB通路促进了IL-6、TNFα、ICAM-1等炎症介质的表达。(2)天然水蛭素皮下注射能降低超长随意皮瓣术后的炎症反应,其机制可能为通过与凝血酶结合而阻断PARs/p38 MAPK/IKK/NF-κB通路,减少了炎症介质IL-6、TNFα、ICAM-1等的表达。第三部分水蛭素通过p38 MAPK/IKK/NF-κB通路影响术后淤血皮瓣中Bax、Bcl-2、Caspase3的表达及细胞凋亡目的:观察大鼠背部超长皮瓣术后皮瓣组织中细胞凋亡的情况及天然水蛭素皮下注射对皮瓣组织中细胞凋亡的影响,并探讨可能的作用机制。方法:第一部分中的实验大鼠在术后即刻和术后第1、2、4、7天采集背部皮瓣组织标本,制备组织切片,采用原位末端转移酶标记法(TUNEL染色)检测皮瓣中细胞凋亡情况;制备组织匀浆提取总蛋白后,采用免疫印迹法(Western blot)和吸光光度法检测皮瓣组织中凋亡相关因子的表达情况。结果:(1)TUNEL:大鼠正常的皮瓣组织中TUNEL阳性细胞零星可见。C组标本中TUNEL阳性细胞数量从术后第1天开始便明显增高(p<0.05 v.s.day0),之后逐渐增多,至术后第4天达峰值,第7天有所回落。H组的TUNEL阳性细胞的数量在术后第1天及第2天并没有明显升高,到第4天时有了明显上升(p<0.05 v.s.day0),第7天进一步上升。术后各时间点H组都较C组为低(p<0.05)。(2)Bax表达量:C组在术后第2天到第7天有显著上升(p<0.05v.s.day0)。H组在术后第4天到第7天有明显上升(p<0.05 v.s.day0)。术后第2、4、7天H组均低于C组(p<0.05)。(3)Bcl-2表达量:C组从术后第1天到第7天先上升后下降,但和正常时比较都无显著差异(p>0.05 v.s.day0);H组术后第1天及第2天略有上升,但和正常时比较无显著差异(p>0.05),到术后第4天到第7天有显著升高(p<0.05 v.s.day0)。术后第4天和第7天,H组明显低于C组(p<0.05)。(4)Bax/Bcl-2比值:C组在术后第2天到第7天有显著升高(p<0.05 v.s.day0)。H组在术后第1、2天较正常时有显著下降(p<0.05v.s.day0),但到术后第4天到第7天时却有明显升高(p<0.05 v.s.day0)。H组术后7天中一直比C组低,组间比较有显著性差异(p<0.05)。(5)Caspase3酶活力值:C组从术后第1天到术后第7天都有显著上升(p<0.05 v.s.day0),其中术后第4天最高。H组从术后第1天到术后第7天也都有显著上升(p<0.05 v.s.day0),但第7天才达到最高值。H组术后各时间点均小于C组(p<0.05)。结论:(1)超长随意皮瓣术后会有细胞凋亡发生,其机制可能为凝血酶通过PARs/p38 MAPK/IKK/NF-κB通路,促进Bax表达增加,使Caspase3酶活力上升,引起细胞凋亡加剧。(2)天然水蛭素皮下注射能减少超长随意皮瓣术后的细胞凋亡,其机制可能为天然水蛭素通过和凝血酶结合而抑制了凝血酶与PARs的结合,阻断了PARs/p38 MAPK/IKK/NF-κB通路,从而抑制了Bax及Caspase3的表达,从而减缓了细胞凋亡的加剧。