舌癌为口腔内最常见的恶性肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤的1％，男性多于女性，病理类型以鳞状细胞癌为主，区域淋巴结转移率较高，治疗采取手术为主的综合治疗。早期舌癌手术切除，中晚期舌癌倾向于手术、化疗与放疗的综合应用。由于颈淋巴结转移灶对放射不敏感，目前比较常用的治疗方法是术前化疗合并手术综合治疗。以外科治疗口腔鳞状细胞癌为例，治疗失败大多由于原发癌未被控制，其中，肿瘤不全切除和癌细胞的创面种植是造成局部复发的主要因素。如在术前给予一定剂量的有效化疗，以杀灭活跃生长的癌细胞或降低其活性，既可为手术切除创造有利条件，又可能减少术后复发率。同时，该部位涉及咀嚼、味觉、发音及吞咽等功能，也是整容的重要部位，治疗重点应是保留器官和功能。化疗在综合治疗中的应用既迎合了最新的器官保留概念，维持器官功能上的完整性又力求在一定程度上提高病人的远期生存率。开发新型低毒高效的舌癌化疗药物成为舌癌综合治疗的新重点。 Manumycin手霉素及相关化合物是发现于链丝菌培养液，直至1993年始发现其有抑癌作用。目前已经证实Manumycin的抑癌作用可通过抑制ras蛋白活化依赖性的法尼基转移酶而产生，口腔鳞癌rasp21的阳性表达率高达82.05％～92.50％，而在正常鳞状上皮组织中则无rasp21蛋白的阳性表达。Manumycin还可以通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)以及表皮生长因子受体(EGFR)的增值发挥抗癌作用，此外，其抑癌作用还与引起细胞活性氧升高有关。大量文献报道头颈鳞癌中表皮生长因子受体的高表达，并有学者已经证实应用不同浓度的表皮生长因子单克隆抗体EGFRmAb处理人舌鳞癌细胞Tca8113能够明显抑制其增殖，且在较低浓度就可以发挥作用。同时舌鳞癌也是VEGF高阳性表达的场所。Tca8113细胞是口腔最常见的鳞癌细胞，其rasp21的高阳性表达率以及高表达的VEGF和EGFR成为Manumycin作用的重要靶点，显示出Manumycin作用于舌鳞癌的良好前景。 Manumycin具有诱导细胞凋亡的作用，但是其机制至今尚未报道。本文主要报道Manumycin对人舌鳞癌细胞Tca8113细胞生长的影响，探讨其分别与顺铂、5-氟尿嘧、平阳霉素、阿霉素联合对Tca8113细胞生长的抑制作用是否具有协同效应并进一步探讨其体外是否具有诱导舌癌凋亡的作用及其机制，以期为今后体内抗癌研究以及促进新型抗舌鳞癌药物的研究与开发或者可能的新型临床化疗方案提供理论依据。 方法 MTT法测定Manumycin单药以及分别与平阳霉素、顺铂、阿霉素、5-氟脲嘧啶联合作用于Tca8113的细胞毒作用，联合用药细胞毒测定以ChouTC中效原理设计；Hoechst33258染色后荧光显微镜观察凋亡细胞形态；AnnexinV染色流式细胞仪检测Manumycin诱导凋亡作用；细胞内活性氧(ROS)和线粒体跨膜电位(△Ψm)分别用DCFH-DA和DiOC6荧光探针标记，流式细胞仪检测；蛋白质定量检测Westernblot法。 结果 1Manumycin对Tca8113细胞生长的影响Manumycin有较强的体外抗肿瘤作用，对Tca8113细胞的IC50为(11.33±0.63)μmol·L-1，表明Manumycin浓度依赖抑制Tca8113细胞的生长，这种作用呈量效关系。联合用药显示在相应比例剂量条件下，Manumycin与顺铂联合呈拮抗作用，与5-氟脲嘧啶联合低浓度呈相互拮抗，高浓度联合呈明显协同作用，Manumycin与平阳霉素、阿霉素联合均呈相互协同的作用。 2细胞凋亡的细胞核形态学改变不同浓度Manumycin处理细胞24h后细胞核出现不同程度的荧光浓染。正常对照组核形规则，染色均匀；当Manumycin浓度高于20μmol·L-1时细胞核出现明显的浓染致密的颗粒块状荧光，并有典型的凋亡小体产生。 3Manumycin诱导Tca8113细胞的凋亡作用本研究证实Manumycin具有诱导Tca8113细胞凋亡的作用，其诱导的细胞凋亡率既是随着Manumycin药物浓度的增加而增加又是随着药物作用时间的增加而增加。5，10，20μmol·L-1Manumycin分别作用Tca8113细胞24h后，细胞凋亡率分别为(7±2)％，(19±5)％和(36±8)％(n=3)；20μmol·L-1Manumycin分别作用于Tca8113细胞12，24，48h后，细胞凋亡率分别为(11±3)％，(35±7)％和(68±10)％(n=3)； 4Manumycin对Tca8113细胞内ROS和△Ψm的影响以20μmol·L-1Manumycin分别处理Tca8113细胞12，24和48h，检测细胞内ROS和△Ψm的变化。Manumycin作用12h，即出现ROS明显增加，MIF增加，峰值出现有意义的向右移动，24h后继续增加，至48h达到最大；而测定线粒体跨膜电位时，发现药物作用于细胞株12和24h后线粒体跨膜电位有所降低，即MIF略有增加；作用48h后线粒体跨膜电位明显降低，峰值明显右移。Manumycin对Tca8113细胞内ROS和△Ψm的影响基本一致，无显著性差异。 5Manumycin诱导Tca8113细胞caspase-3，9的活化引起凋亡通路的激活20μmol·L-1Manumycin分别作用于Tca8113细胞12，24，48h后，Caspase-3，9，出现不同程度裂解，并且在Manumycin作用48h后出现了明显的裂解片断，裂解程度与药物作用时间长短呈正比。进一步检测caspase激活底物PARP也发现在20μmol·L-1Manumycin不同时间的作用下也分别出现不同程度的降解，这表明，Manumycin能够诱导Tca8113细胞凋亡的机制之一可能是引起caspase依赖性激活最终导致Tca8113细胞的凋亡。 6N-乙酰半胱氨酸抑制Manumycin诱导的细胞凋亡为了明确活性氧在凋亡事件中发挥的作用，以N-乙酰半胱氨酸作为活性氧清除剂参与Manumycin作用于Tca8113细胞后，观测其核型及胞内活性氧的变化。荧光显微镜下观察凋亡细胞核型可见细胞经过不同处理24h后，正常对照组核形规则，染色均匀。20μmol·L-1Manumycin药物单独处理组出现明显的浓染致密块状荧光，可见凋亡小体产生，10mmol·L-1NAC单独处理组与正常对照组类似，同时加入Manumycin与NAC组个别细胞出现轻度深染，与正常对照组差别微小。流式细胞仪检测24h后胞内活性氧的变化显示10mmol·L-1NAC单独处理组与对照组相比ROS略降，20μmol·L-1Manumycin单独处理组其ROS水平明显升高，而同时加入Manumycin与NAC组其ROS水平显著降低，降至与对照组无统计学差别，提示Manumycin引起的活性氧的升高可以被活性氧清除剂清除进一步确定Manumycin可以升高Tca8113细胞的活性氧水平，降低膜电位从而诱导细胞凋亡。 结论 1Manumycin体外显著抑制舌鳞癌Tca8113的生长，呈量效关系，IC50为(11.33±0.63)μmol·L-1。Manumycin与平阳霉素、阿霉素以及与5-氟脲嘧啶高浓度联合作用于Tea8113细胞呈相互协同的细胞毒作用。 2Manumycin诱导细胞凋亡可能通过激活线粒体依赖性凋亡通路，引起细胞内活性氧升高，线粒体跨膜电位降低有关。 3Manumycin诱导细胞凋亡可能与引起casepase活化物的释放有关。