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化疗是目前治疗恶性肿瘤的有效手段之一。但在化疗中由于常见的骨髓，抑制，限制了化疗药物的使用剂量，进而影响了临床治疗的疗效。肿瘤耐药基因治疗的研究为解决化疗所引起的骨髓抑制提供了可能。通过导入的外源耐约基因保护造血干细胞，临床上有可能通过提高化疗药物的剂量，最大限度的杀伤肿瘤细胞，以提高疗效。本课题在应用免疫磁珠法获取高纯度造血cD34+细胞及优化造血干细胞体外培养体系的基础上，将逆转录病毒载体介导的人mDHFR肿瘤耐药基因导入脐血或动员的人外周血CD34+细胞，并在体外及SCID-hu小鼠模型中评估了转导该耐药基因的人造血干细胞对MTX毒性的抵抗作用。主要结果如下： 人造血CD34+细胞的分离纯化和体外扩增培养： 分别采用Panning法和miniMACS抗CD34免疫磁珠分选法分离纯化人脐血和外周血CD34+细胞。结果发现Panning法分选后CD34+细胞的平均纯度为21.7％，回收率为15.7％；而免疫磁珠法分选后可获得高纯度cD34+细胞，其纯度可达82.9％--97.1％，平均为91.8％，回收率为65.7％，明显高于Panning法。 应用SCF／IL-3，SCF／IL-3／IL-6，SCF／IL-3／G-CSF，SCF／IL-3／IL-6／G-CsF，SCF／IL-3／IL-6／G-CSF／EPO，IL-3／G-CSF等六种不同组合的造血生长因子体外培养扩增人脐血cD34+细胞，各种组合方式均能使造血祖细胞有不同程度的扩增。但加有系特异性刺激因子组细胞总数的扩增明显高于无系特异性刺激因子组，其中以SCF／IL-3／IL-6／G-csF／EPO组合扩增效率最高，在第1，2，3周分别扩增了52，148，及300倍以上。但是，有系特异性刺激因子组的人造血祖细胞克隆形成cFCs在经1--2周的10--20倍左右的扩增后，其扩增能力急剧丧失。而无系特异生长因子组cFCs的扩增能力能维持相对长的时间，在SCF／IL-3／IL-6组，第三周cFCs的扩增仍可达25倍。 应用动员的人外周血CD34+细胞进行体外培养扩增也得到与上述相类似的结果；但是，动员的人外周血CD34+细胞在体外的扩增能力较脐血cD34+细胞的扩增能力弱，经1--3周培养后其细胞总数和cFCs扩增倍数分别较脐血CD34+细胞扩增低1.7--2.7倍和1.4--2.5倍。这提示脐血CD34+细胞有更强的增殖潜能。 在造血干细胞体外培养体系中，骨髓基质细胞和造血生长因子共同支持组的造血cD34+细胞在体外培养三周后，其克隆形成能力较单纯造血生长因子支持组高30.7％。提示基质的支持有助于人CD34+细胞保持其造血潜能。 转导有mDHFR耐药基因的人造血cD34+细胞在体外对MTX的抗性作用； 含有人mDHFR耐药基因的Am12-s31逆转录病毒转导6例脐血造血干