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聚-β-羟基烷酸是微生物代谢过程中产生的贮存物质,可被微生物完全降解,是一类新型高分子热塑材料,在工业、农业、医药、食品、环保行业有着广阔的应用前景。本研究利用低能氮离子注入方法对出发菌pCB4进行改良,研究了离子注入适宜的技术参数,进行了产PHA突变体的筛选和突变体遗传稳定性分析,利用PCR技术和生物信息学方法分析了突变体的分子机制,获得如下主要结果:
1.采用低能氮离子注入出发菌pCB4后,呈现出一种先降后升再降的“马鞍型”剂量存活曲线。确定出发菌最适注入能量为10keV、注入剂量为7.8x10<14>N<+>/cm<2>。
2.通过多轮诱变筛选,最终获得了一株高产菌株,并将其命名为pCBH4,对该菌株进行了进一步传代实验,结果表明该菌株在合成PHA性状上具有遗传稳定性;通过提取pCBH4突变菌株含合成PHA基因的质粒转化受体菌DH5a,证实高产PHA是由于质粒合成PHA相关基因突变所致。
3.研究对所得的PHA样品进行气相色谱分析。结果表明,突变体PHA样品中组分主要为PHB,占41.33%,比对照提高了48.78%,而样品中其它成分含量则较少,这说明突变主要利于催化合成PHB。
4.根据原始序列设计引物,从突变株pCBH4中扩增出了phaA、phaB和phaC基因,并对其进行了序列分析,发现突变体phaA基因在序列末端有七处碱基发生改变,导致5个氨基酸发生变化。phaC基因在序列末端有也有七处碱基发生改变,导致5个氨基酸发生改变。碱基突变以颠换为主,颠换频率为78.57%,转换频率为21.43%。突变株phaA和phaC基因碱基和氨基酸序列的变异导致DNA及蛋白质二级结构和部分性质的变化,而phaB基因的碱基序列未观测到变化。
5. 对突变株pCBH4的发酵条件进行了研究。选用蛋白胨作为氮源,当接种量为8%,培养基初始pH7.0,摇瓶培养24h,再静止培养36h时,能获得较大的生物量、PHA浓度和PHA含量,分别为2.26g/L, 1.81g/L和80.08%,分别比对照提高了82.26%,196.72%和62.80%。