由于人类基因组计划的完成和蛋白质组学研究的开展,对于基因功能的研究不再以单一基因为对象,更为普遍的是采用系统性的研究方法,以全基因组为对象进行功能解析。因此,更为有效的、高通量的基因功能研究手段在近年来得到越来越多的重视。其中大规模的RNAi文库成为在全基因组规模系统研究基因功能的强有力工具。RNAi文库是人工构建的能通过RNAi机制诱导众多不同基因表达的组合文库。通过RNAi文库可以同时对多个基因的表达水平进行下调,从而研究其对应蛋白的功能。由于shRNA的特殊茎环结构,目前构建shRNA载体的方法大多需要合成长的引物,因此重组质粒突变率高且载体构建成本高。同时,由于插入片段小,克隆重组子筛选工作复杂。为了高通量构建shRNA表达载体,本研究发展了一个新的不依赖连接酶的shRNA表达载体构建方法。首先在载体克隆位点设计切刻酶位点Nb.BbvCI和限制性内切酶位点BfuI的组合,载体经这两种酶酶切后,线性化载体的克隆位点会带有长的粘性末端（12bp）。然后设计针对干扰单元靶点的一对引物,引物两端带上与载体粘性末端互补的序列,同时让引物在体外条件下退火。最后引物退火产物与线性化载体在体外条件下孵育,互补的粘性末端退火形成环状分子,经转化进大肠杆菌细胞后,细菌的修复系统修复突出的缺口而得到正确的重组子,即我们需要的shRNA重组载体。这种构建shRNA载体的方法不需要目的DNA的纯化、酶切和连接,不需要合成传统方法所需的长引物（约60bp）。本研究用这种新方法成功构建了20个shRNA重组载体,实验结果表明该方法克隆效率高于90%,构建的shRNA重组载体测序准确率在85%以上。我们应用本方法构建了针对p53和egfp基因的shRNA重组质粒载体,并检测重组质粒载体表达的siRNA的干扰效果,实验结果表明,用本实验构建的shRNA重组载体具有理想的干扰效果。在此基础上,我们将该方法运用于慢病毒shRNA载体的构建,成功构建了6个shRNA重组慢病毒载体。在进一步的研究中,我们计划大量构建shRNA重组慢病毒载体并检测重组慢病毒载体的干扰效果。从而达到构建慢病毒shRNA表达载体文库的目的。