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牦牛是青藏高原生态系统的特有畜种,其体貌特征、生理特点、牧食习性均有别于其它低海拔牛种。近年来研究发现,牦牛具有区别于其它低海拔牛种的适应高寒营养胁迫的独特氮循环代谢机制,其中应包括小肽吸收机制。小肽作为蛋白降解和参与合成蛋白的含氮营养物质,其在胃肠道的转运吸收主要通过PepT1的跨膜转运完成。目前围绕低海拔动物鸡、猪、绵羊、黄牛PepT1分子基础及调控机理已有相关报道,但针对高原反刍动物小肽转运载体PepT1的相关研究尚属空白。因此,本论文通过对牦牛PepT1基因的克隆、组织表达分布特征,以及活性调控的研究,旨在初步揭示牦牛吸收转运小肽的分子基础及调控机理。相关研究的深入开展,不仅可以丰富高原反刍动物蛋白质营养理论及研究手段,进而完善牦牛补饲策略,减少因日粮养分供给不平衡而造成的环境污染,具有长远的生态效益。研究内容包括:1)牦牛小肽转运载体PepT1的克隆及生物学分析;2)牦牛PepT1组织表达分布特性及比较研究牦牛与本地黄牛PepT1mRNA表达对日粮氮水平的响应;3)比较研究牦牛与本地黄牛PepT1mRNA表达在CHO-k1细胞中对底物小肽的响应特征。主要研究结果如下:1)通过RT-PCR和RACE末端快速扩增法克隆得到:牦牛小肽转运载体PepT1(yPepT1;Genbank:KT725253)全长包含2805bp,编码707个氨基酸,其中含有5个N-糖基化位点、2个PKA位点、3个PKC位点;预测该序列存在12个跨膜区,等电点(pI)为7.1,蛋白分子量为78.4kDa;无信号肽,为非分泌性蛋白。牦牛PepT1序列中Val(9.1%)含量最高,最低的为Trp(1.3%);非极性(疏水)AA占47.81%,极性(亲水性)AA占52.19%,为亲水性氨基酸;二级结构预测yPepT1编码的AA含有α螺旋、β折叠和无规则卷曲。系统进化分析亦发现牦牛与黄牛亲缘关系最近;同源性比对yPepT1与黄牛、绵羊、野猪、藏猪、人类、小鼠和家兔PepT1的同源性分别为:99%、95%、86%、85%、83%、81%和79%,其中yPepT1与黄牛PepT1的AA序列在第258、515、536、544个AA处存在差异。2)放牧牦牛PepT1mRNA在胃肠道各组织、肾脏和乳腺组织中均有表达,其中,空肠表达量最高,且显著高于其他组织(P<0.001),回肠和十二指肠次之,网胃和乳腺相对较低;其他组织相对表达量由高到低依次为瘤胃、瓣胃、结肠、皱胃、盲肠、肝脏及肾脏,其中皱胃、盲肠、肝脏及肾脏表达水平极低。3)牦牛和本地黄牛饲养和屠宰对比试验结果表明:PepT1mRNA在各组织中的表达量受基因型,日粮氮水平及二者交互影响。牦牛与本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在瘤胃、瓣胃、十二指肠、空肠、回肠和肝脏组织存在基因型差异(P<0.05);在瘤胃、网胃、十二指肠、回肠组织中存在氮水平差异(P<0.05);随着日粮氮水平的增加,两基因型牛PepT1mRNA在瘤胃、瓣胃和回肠组织中线性增加(P<0.05),而在十二指肠和肝脏组织中呈线性下降(P<0.05)。在低氮(10.32g N/kg DM)水平下,本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在瓣胃、十二指肠、回肠和肝脏显著高于牦牛,而在空肠,牦牛显著高于本地黄牛(P<0.05);在中低氮水平(19.49gN/kg DM)条件下,本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在瘤胃、网胃、瓣胃、空肠和肝脏显著高于牦牛,而在回肠牦牛显著高于本地黄牛(P<0.05);在中高氮(28.50g N/kg DM)水平条件下,本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在瘤胃、瓣胃、十二指肠、回肠和肝脏显著高于牦牛,而在网胃牦牛显著高于本地黄牛(P<0.05);在高氮水平条件下(37.6g N/kg DM),本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在十二指肠和回肠显著高于牦牛,而在空肠牦牛显著高于本地黄牛(P<0.05)。这表明牦牛存在有别于黄牛的小肽吸收转运机制,且牦牛更能适应营养胁迫条件以适应其极端的生存环境。4)借助分子生物学方法成功构建牦牛和本地黄牛真核质粒表达载体pcDNA3.1-yPepT1和pcDNA3.1-bPepT1,并建立pcDNA3.1-yPepT1和pcDNA3.1-bPepT1质粒表达载体转染中国仓鼠卵母细胞(CHO-k1)的外源表达模型。通过yPepT1和bPepT1在CHO-k1细胞中瞬时表达,检测重组蛋白yPepT1和bPepT1对底物小肽的响应。结果表明:PepT1mRNA相对表达量存在基因型、小肽处理及两者交互的影响。添加小肽组PepT1mRNA相对表达量较对照组均有不同程度的增加,其中,牦牛PepT1mRNA相对表达量在Met-Lys、Lys-Met、Let-Lys、Thr-Ser-Lys、Lys-Try-Lys、Met-Gly-Met-Met组显著高于CKy组(P<0.05),而Met-Met、Leu-Ser-Phe、Lys-Thr-Ser与CKy组无显著差异(P>0.05);本地黄牛PepT1mRNA相对表达量在Met-Met、Met-Lys、Lys-Met、Lys-Lys、Leu-Ser-Phe、Lys-Thr-Ser、Thr-Ser-Lys组显著高于CKb组(P<0.05),而在Lys-Try-Lys和Met-Gly-Met-Met组与CKb组无显著差异(P>0.05)。此外,二肽处理组中,Met-Lys和Lys-Lys组PepT1mRNA相对表达量本地黄牛显著高于牦牛(P<0.05);三肽处理组中,Leu-Ser-Phe和Lys-Thr-Ser组PepT1mRNA相对表达量本地黄牛显著高于牦牛(P<0.05),而Lys-Lys组牦牛显著高于本地黄牛(P<0.05)。综上,牦牛与本地黄牛PepT1分子序列的差异、日粮氮调控的差异和底物调控的差异,表明牦牛具有有别于黄牛小肽吸收转运基础,这种差异性有利于其适应青藏高原生态环境。