四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)是芳香族氨基酸羟化酶的必需辅酶,同时,也是一氧化氮合酶和烷基甘油单加氧酶必需的辅因子,其合成不足或代谢缺陷会导致哺乳动物罹患多种神经性疾病。目前研究得比较清楚的是BH4的生物合成分为三条途径,即以GTP为初始底物,经过三个酶的催化最终生成BH4的从头合成途径,以中间产物墨蝶呤为底物,经过两步反应生成BH4的补救合成途径,以及BH4参与催化反应后,经过两个酶的催化重新生成BH4的重生途径。但是BH4生物合成的调控网络中尚存不明之处:当从头合成途径受阻或部分受阻发生时,选择性合成支路及其调控因子的作用机制有待探明;不同合成途径在生物体内的时空作用模式及功能地位尚不清楚。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目的模式昆虫,遗传背景清晰,目前基因组框架图和精细图均已完成,数据库信息完善。国内外保存有数百种家蚕突变体种质资源,包括很多研究人类疾病相关问题的宝贵生物资源。家蚕黄体色lemon(lem)、黄体色致死lemon lethal(leml)以及白化致死体albino(al)等突变体是不同程度的BH4合成缺陷型,是研究BH4合成代谢途径及其调控机理的理想模型。本研究利用家蚕野生型品系大造(p50),BH4合成相关突变品系以及家蚕BmN细胞系为材料,对家蚕BH4合成代谢途径的基因进行网络克隆鉴定,表达互作模式及其调控BH4合成功能等方面的研究,主要获得以下结果:1.从家蚕野生型品系p50五龄三天的幼虫中克隆得到了BH4重生途径中的蝶呤-4α-甲醇胺脱水酶基因(BmPcd)和二氢喋啶还原酶基因(BmDhpr),通过序列比对发现,这两个基因与其他物种相应基因的同源性较高,与果蝇的同源性最高。对两个基因在不同突变品系中的时空表达模式进行了分析,发现两个基因的时空表达模式存在较大差异。通过大肠杆菌表达系统表达并纯化得到了BmPCD和BmDHPR蛋白,对重组BmDHPR蛋白进行了酶学特性鉴定,重组BmDHPR蛋白在室温和pH为7的条件下活性最高,对辅酶NADH的亲和性大于NADPH,对底物DMPH2亲和性较差显示出较高的底物专一性。基于p50和lem突变体品系ah09的体内比较酶活实验结果表明,当从头合成途径受阻导致BH4合成不足时,B.mori主要激活脑和性腺等组织的重生途径。2.针对BH4从头合成途径中的墨蝶呤还原酶基因BmSpr,补救合成途径中的二氢叶酸还原酶基因BmDhfr和重生途径中的BmDhpr等基因分别设计了2-4条合适的shRNA,并构建了相应的RNA干涉载体。分析了不同转染试剂对干涉载体转染BmN细胞转染效率的影响,并利用荧光定量RT-PCR的方法筛选出了干涉效果较好的shRNA干涉载体。在BmN细胞中,发现干涉BmDhfr的表达对其他BH4合成相关基因的表达无明显影响,但干涉BmSpr的表达使BmPtps和BmDhfr的表达明显上调。以上结果说明BH4的从头合成途径受到抑制时,补救合成途径可能会发挥积极作用;相较SPR来说,GTPCH和PTPS是BH4从头合成途径的更为重要的限速酶。另外,通过蚕卵显微注射的方式进行了shRNA介导的转基因干涉BmSpr表达的初步实验。3.以哺乳动物参与BH4合成相关的醛酮还原酶(AR)和羰基还原酶(CR)的氨基酸序列为查询对象,在中日家蚕基因组数据库和全长cDNA文库进行同源基因BLAST检索,共得到了14个家蚕醛酮还原酶基因(BmAr)的17个转录本,以及8个家蚕羰基还原酶基因(BmCr)的9个转录本,分别构建了不同物种间AR的进化树和CR的进化树,发现BmAR12和BmAR13与已报道的BH4合成相关的AR亲缘关系最近。半定量RT-PCR分析了所有BmAr,BmCr预测基因在p50和ah09品系中的表达差异模式,推定BmAR2和BmCR3可能参与家蚕BH4的合成代谢途径。综上所述,补救途径和回收途径在家蚕BH4合成代谢系统中可能具有较为重要的生物学功能,本研究所取得的进展为今后全面阐释家蚕BH4合成代谢网络的分子调控机制奠定了必要的生物化学与分子生物学实验基础,为开展将家蚕BH4合成缺陷型突变体作为人类相关疾病模型的应用基础研究提供了理论依据。