缺血性脑血管病以其发病率高、死亡率高、致残率高的特点严重影响了人民的生命健康和生活质量,给社会和家庭造成沉重的负担。缺血再灌注(I/R)引起神经元凋亡是导致脑组织损伤的主要原因。而线粒体ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂二氮嗪(DZX),能够降低神经细胞凋亡率,对神经元的损伤有保护作用。目前二氮嗪(DZX)在保护神经元上的分子机制尚不明确。因此,本课题通过细胞分子生物学技术试图探究二氮嗪(DZX)对神经保护的分子机制。目的:第一部分:探索ATP敏感K通道基因表达与脑神经元损伤之间的关系,试图对KATP通道开放剂DZX治疗脑神经元损伤的相关基因及其可能的下游靶标进行观察。第二部分:探索ATP敏感钾通道开放剂DZX作用对氧糖剥夺引起的海马神经元损伤的保护作用,试图说明DZX减少神经凋亡的作用和机制。第三部分:探索ATP敏感钾通道开放剂DZX对缺血再灌注中大鼠神经损伤的保护作用。第四部分:寻找DZX与下游靶分子之间存在lnc RNAs“桥梁”分子,并研究它们之间调控关系,进一步说明DZX对损伤神经元有保护作用。方法:第一部分:通过生物信息学分析在脑缺血再灌注中ATP敏感性钾通道差异表达的基因;对海马脑片进行氧糖剥夺处理:进一步应用膜片钳检测不同药物预处理海马脑片氧糖剥夺模型后,海马神经元KATP通道电流的变化。第二部分:通过分离培养海马神经元,构建氧糖剥夺的海马神经元细胞和脑片模型;应用细胞免疫荧光法、MTT法、LDH测定法、TUNEL染色法来鉴定模型构建情况;对原代海马神经元细胞进行不同处理,分为:NC组,OGD组,DZX+OGD组,DZX+5-HD+OGD组,TG+DZX+OGD组,用流式细胞技术分别检测各组的海马神经元细胞的凋亡率。和应用RT-PCR检测法检测在不同药物作用下氧糖剥夺的海马神经元细胞和脑片中凋亡相关基因caspase3,caspase12,Bax表达的改变情况。第三部分:采用线栓塞法构建缺血再灌注大鼠模型,采用脑立体定位侧脑室注射法给药,TTC染色法鉴定模型构建情况;应用神经功能缺损评分了解神经损伤严重程度;对动物模型进行不同处理分为以下四组:假手术组,DZX+I/R组,DZX+5-HD+I/R组,DZX+TG+I/R组,对经过不同处理大鼠应用水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力;应用TTC染色法检测大鼠脑梗死面积变化情况;应用HE染色法检测大鼠脑梗死面积的组织学变化情况和应用TUNEL检测法检测大鼠脑组织细胞凋亡变化情况。第四部分:通过lnc RNA芯片分析寻找DZX与下游靶分子之间存在lnc RNAs“桥梁”分子;缺血再灌注模型大鼠分为假手术组、I/R组、DZX+I/R组、DZX+5-HD+I/R组,DZX+TG+I/R和DZX+5-HD+TG+I/R组,各组应用RT-PCR验证差异基因,发现lnc RNA S66184的表达与DZX密切相关;构建氧糖剥夺的海马神经元细胞模型,应用lnc RNA过表达转染实验及RT-PCR技术,验证DZX对lnc RNA S66184的调控关系。结果第一部分:1.通过GSE23160芯片分析挖掘出与脑缺血再灌注大脑皮层(Cortex)和脑纹状体(Striatum)中KATP敏感表达异常的基因,其中有7个差异基因同时存在皮质和纹状体中,这7个基因是GPR84、GJB2、DSCR1、TLR2、GPR84、GJB2、CDKN1A。在脑缺血再灌注24小时内表达量显示:皮质中KATP敏感基因GPR84、GJB2、DSCR1、TLR2、GPR84、GJB2随着脑损伤程度的增加(及缺血时间的增加)而增加;CDKN1A在缺血再灌注8小时的时候表达量达到最大,随后随缺血再灌注时间的增加下降;在脑缺血再灌注24小时内纹状体中KATP敏感基因GPR84、GJB2、TLR2、GPR84、GJB2随着脑损伤程度的增加(及缺血时间的增加)而增加;DSCR1、CDKN1A在8小时的时候达到最高状态,随后随缺血再灌注时间的增加下降。2.观察神经元KATP通道电流变化的膜片钳实验结果显示,OGD组电流显著升高表明造模成功。相对正常组KATP电流密度(53.3±5.3),OGD组的电流密度(93.2±5.4)显著增高,DZX+OGD组的电流密度恢复到正常组大小(53.2±3.0),DZX+5-HD+OGD组(83.4±4.8)升高表明5-HD部分抑制DZX的神经保护作用。TG+DZX+OGD组的KATP通道电流密度为(66.9±11.1),明显低于OGD组,但与DZX+OGD组相比稍高,这表明DZX可部分抑制ERS通路从而对OGD引起的神经元损伤有保护作用。第二部分:1.原代海马神经元的培养及鉴定:培养72h可见神经元伸出的多个突起进一步伸长,可观察到突起末端的生长锥,还常见到多个神经元聚集在一起,向四周发出树枝状神经突起,形成稀疏的神经网络,随着时间延长,突起延长增粗,网络变得稠密,神经元胞体逐渐增大。用FITC标记的MAP2和PE标记的Tau-1抗体染色鉴定神经元,Hoechst 33258染细胞核,荧光显微镜下观察神经元树突被染上了绿色,轴突染上红色,细胞核染上蓝色。以上结果证明通过原代培养所得到的细胞确实是海马神经元细胞。2.MTT检测氧糖剥夺后海马神经元细胞的活性:经氧糖剥夺处理后,与正常组相比,氧糖剥夺处理组中海马神经元细胞的吸光值明显下降,说明活细胞的数量再减少(p<0.05)。而且随着氧糖剥夺后时间的延长,死亡的海马神经元细胞越多。3.LDH释放量的测定:经氧糖剥夺后,与正常组相比,氧糖剥夺组中海马神经元细胞LDH的释放量比正常细胞显著增大(p<0.05),而且随着氧糖剥夺后时间的延长,释放的LDH越来越多,说明死亡的海马神经元细胞也越来越多。4.大鼠海马脑片氧糖剥夺模型用TUNEL染色方法鉴定:与正常组相比,氧糖剥夺组中有大量的染色成棕色的阳性细胞,说明在氧糖剥夺模型组中有大量凋亡的细胞出现。成功构建了大鼠脑片的氧糖剥夺模型。5.流式检测海马神经元细胞的凋亡情况:与NC相比,OGD组海马神经元细胞的凋亡显著增多(P<0.05)。DZX+OGD组海马神经元细胞凋亡率比OGD组凋亡率明显减少(P<0.05)。DZX+5-HD+OGD组中海马神经元细胞的凋亡率比DZX+OGD组显著增加(P<0.05),但是还是比OGD组中海马神经元的凋亡率要低(P<0.05)。TG+DZX+OGD组中海马神经元细胞的凋亡率比DZX+OGD组显著增加(P<0.05),但是还是比OGD组中海马神经元的凋亡率要低(P<0.05)。该结果表明钾离子通道开放剂能抵抗由ERS引起的海马神经元细胞的凋亡。6.RT-PCR检测凋亡密切相关基因:与正常对照组相比,模型组中Bax,Caspase-3,Caspase-12的表达量显著高于正常对照组中,用DZX处理后,Bax,Caspase-3,Caspase-12的表达量显著减少。当用钾离子通道阻断剂5-HD和ERS诱导剂毒胡萝卜素TG和DZX一起处理大鼠海马神经元OGD和大鼠海马脑片OGD模型后,Bax,Caspase-3,Caspase-12的表达量与DZX+OGD组相比又显著增加,但又低于模型组。这些结果显示DZX能保护脑组织,缓解细胞凋亡。第三部分:1.线栓塞法脑缺血模型后24小时后,与正常组相比,取材后发现在脑缺血模型组中可见明显的脑梗死部分。因此我们认为用线栓塞法已经成功构建了脑缺血模型。2.各组大鼠平台逃避潜伏期的比较:在大鼠建模完成后,开始进行水迷宫实验,第1天假手术组潜伏期为24.8±4.12s,而I/R模型组大鼠的潜伏期明显延长为79.5±6.33s(p<0.05),DZX+I/R组潜伏期明显缩短为48.6±5.71s(p<0.05),DZX+5-HD+I/R组显著延长了潜伏期时间为89.3±9.83s(p<0.05)。第2和第3天各组的潜伏期均呈现下降趋势,而I/R模型组的潜伏期时间显著高于假手术组和DZX+I/R组。3.各组大鼠空间探索实验结果比较:水迷宫实验开始后的第4天平台撤除后,观察各组大鼠的记忆能力。结果显示,假手术组大鼠停留平台象限时间达到33.12±3.34s,I/R模型组的时间为18.56±3.56s,DZX+I/R组为24.23±4.45s,DZX+5-HD+I/R组为16.45±5.67s,各组穿越原平台次数分别为4.1±1.2次,1.2±0.2次,2.8±0.3次和1.8±0.5次。模型组大鼠在原平台象限的停留时间与假手术组相比明显减少,穿越原平台象限的次数也明显减少,二治疗组大鼠在原平台象限的停留时间时间较模型组大鼠可见显著延长,同时其穿越原平台的次数也有显著增加,差异有统计学意义(P<0.01);各组大鼠的游泳速度相比较之间无显著差异(P>0.05)。4.神经功能缺损评分统计分析:与假手术组比,模型组大鼠神经功能缺损得分明显升高(5.86±0.63),说明已经成功造模,造模后神经损伤严重。与模型组比,DZX+I/R组神经功能缺损得分显著降低(2.63±0.31),DZX+5-HD+I/R组神经功能缺损得分再次显著升高(5.12±0.51)。5.大鼠脑梗死面积:相对于模型组,DZX+I/R组脑梗死面积显著减少(P=0.005),DZX+5-HD+I/R组的脑梗死面积也减少(P=0.044)。6.大鼠脑梗死面积的组织学分析:假手术组中脑组织比较完整,无明显异常。但与假手术组相比,在I/R组中可见明显的坏死脑组织。DZX+I/R组脑部未见明显的坏死组织。DZX+5-HD+I/R组脑部有明显的坏死组织,但是坏死组织比单纯的模型组少。7.TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡:TUNEL法染色后20倍物镜下观察,凋亡细胞胞核深染,呈棕黄色至褐色。假手术组只有较少的细胞凋亡,假手术组的凋亡指数为(0.33±0.05)。与假手术组相比,模型组中有较多的凋亡细胞,模型组中的凋亡指数为(2.33±0.82)。DZX+I/R组中凋亡的细胞显著减少,其凋亡指数为(1.33±0.72)。DZX+5-HD+I/R组凋亡数目明显增加,其凋亡指数为(1.53±0.52)。第四部分:1.脑缺血再灌注大鼠海马神经元进行大鼠lnc RNAs基因芯片检测:我们在假手术组和I/R组的脑组织进行lnc RNA基因芯片分析,通过p值和FDR值的阈值确定,有12条lnc RNAs在I/R组明显上调。各组应用RT-PCR验证差异基因,在脑组织中检测这12条lnc RNAs的表达情况,发现lnc RNA S66184的表达与DZX密切相关。2.大鼠海马神经元中验证lnc RNA S66184的表达:DZX+I/R组与I/R组对比发现lnc RNA S66184明显下调。3.大鼠海马神经元细胞的糖氧剥夺细胞模型中验证lnc RNA S66184的表达:与正常对照组相比,在大鼠海马神经元细胞糖氧剥夺模型里,lnc RNA S66184明显上调。4.大鼠海马神经元细胞的糖氧剥夺细胞模型与凋亡相关基因之间的关系:RT-PCR的方法来检测糖氧剥夺与凋亡相关基因的关系。与正常组相比,氧糖剥夺组凋亡相关基因caspase3、caspase7、caspase8、caspase9、caspase12、Bax明显上调。5.大鼠海马神经元细胞的糖氧剥夺细胞模型中DZX与凋亡基因之间的关系:对原代海马神经元细胞进行不同处理分为:NC组,OGD组,DZX+OGD组,DZX+5-HD+OGD组,RT-PCR检测相关凋亡基因。与OGD组相比DZX+OGD组的凋亡相关基因被下调,与DZX+OGD组相比DZX+5-HD+OGD组凋亡相关基因被上调,但未超过OGD组凋亡相关基因表达。6.在大鼠海马神经元细胞的糖氧剥夺细胞模型中DZX与lnc RNA S66184对凋亡基因之间的关系:前面得到的lnc RNA S66184,在大鼠海马神经元细胞的糖氧剥夺细胞模型里加入DZX后过表达其表达,DZX对caspase3,caspae12,Bax下调作用被逆转。结论第一部分:1.通过生物信息学GSE生物芯片分析证实ATP敏感性钾离子通道参与了氧糖剥夺神经元损伤病理过程。其中有7个差异基因同时存在皮质和纹状体中。2.通过电生理膜片钳检测发现KATP开放剂二氮嗪(DZX)可部分抑制ERS通路从而对OGD引起的神经元损伤仍有保护作用。第二部分:1.通过采用原代细胞分离技术成功构建大鼠海马神经元OGD。2.通过流式细胞凋亡检测说明ATP敏感钾通道开放剂DZX对氧糖剥夺引起的海马神经元损伤有到保护作用。3.通过分别对氧糖剥夺引起的海马神经元细胞和海马脑膜片进行研究,观察到ATP敏感钾通道开放剂DZX能抵抗由ERS引起的海马神经元细胞的凋亡。4.ATP敏感钾通道开放剂DZX通过对凋亡相关基因的调控实现对海马神经元细胞凋亡的抑制。第三部分:1.通过采用线栓塞法构建脑缺血再灌注的大鼠模型。2.ATP敏感钾通道开放剂DZX对大鼠I/R损伤有明显的保护作用。3.ATP敏感钾通道开放剂DZX对MCAO大鼠的不同时间学习记忆能力有改善作用。第四部分:1.我们通过对动物假手术组和I/R组的脑组织进行lnc RNA基因芯片实验分析发现I/R组上调了12条lnc RNAs。2.通过对lnc RNA芯片数据验证发现lnc RNA S66184的表达与DZX密切相关。3.在动物体内实验和体外细胞实验验证发现ATP敏感钾通道开放剂DZX与lnc RNA S66184存在调控关系。4.ATP敏感钾通道开放剂DZX对某些凋亡基因的调控作用与动物模型里的实验结果一致。5.ATP敏感钾通道开放剂DZX通过调控lnc RNA S66184进而调控caspase3,caspase12,Bax的表达,以达到对损伤神经元的保护作用。全文结论综上所述,根据实验数据,我们有理由推测KATP通道开放剂DZX抑制缺血性脑损伤引起的ERS反应,可能是通过lnc RNA S66184进而调控caspase3,caspase12,Bax的表达,能够抑制海马神经元的凋亡,从而对缺血性脑损伤的发生发展产生显著的抑制作用。