子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤,虽然流行病学调查发现肥胖、糖尿病、高血压是子宫内膜癌发病的高危因素,由于目前子宫内膜癌发病机制尚不明了,这些代谢性疾病在其发生发展过程中的作用则无法准确定位,严重影响了对子宫内膜癌发病的有效控制。深入研究子宫内膜癌发病机制将有助于对子宫内膜癌的预防并改善其预后。乙二醛酶Ⅰ(GlyoxalaseⅠ,GLO-Ⅰ)是细胞代谢,尤其是糖代谢过程中十分重要的酶蛋白,扮演“促细胞素”的角色。新近的基础研究结果显示GLO-Ⅰ在细胞增生和凋亡的调控过程中具有十分重要的作用。而作为GLO-Ⅰ的代谢底物,甲基乙二醛(Methylglyoxal,MG)在细胞代谢过程中有着“抑细胞素”的关键角色,是细胞增生和凋亡的重要平衡因子。越来越多的研究表明,GLO-Ⅰ和MG在细胞糖代谢中的作用直接影响到多种肿瘤的发生,尤其是在细胞增生和凋亡的调控环节。但其与子宫内膜癌发病的关系及其对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响尚未见研究报道。本课题从研究GLO-Ⅰ在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织和细胞系中的表达和酶活性入手,利用RNA干扰(RNAi)技术抑制子宫内膜癌细胞中GLO-Ⅰ的表达,并运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、流式细胞仪检测、MTT等研究手段,探讨GLO-Ⅰ在子宫内膜癌细胞增生、凋亡中的作用。本课题共分三个部分:①GLO-Ⅰ在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织、细胞系中的表达;②GLO-Ⅰ在新鲜正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中酶活性水平及其差异;③GLO-Ⅰ对子宫内膜癌细胞增生、凋亡的影响。第一部分GLO-Ⅰ在子宫内膜癌中的表达目的检测GLO-Ⅰ在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织和细胞系中的表达,探讨GLO-Ⅰ与子宫内膜癌的可能关系。方法应用免疫组织化学方法、RT-PCR、Western blot方法检测GLO-ⅠmRNA和蛋白在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织和细胞Ishikawa中的表达,比较它们之间的表达差异。结果(1) GLO-ⅠmRNA在正常子宫内膜和子宫内膜癌细胞中均有表达。子宫内膜癌细胞中GLO-ⅠmRNA的表达水平显著高于正常子宫内膜间质细胞,P＜0.01。(2)GLO—Ⅰ蛋白在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中的表达差异显著,P＜0.01。正常子宫内膜组织中无GLO-Ⅰ蛋白表达。子宫内膜癌组织中,GLO-Ⅰ蛋白表达的阳性率为75.86%。(3)子宫内膜癌细胞经过RNA干扰后,GLO-ⅠmRNA表达量显著低于空白对照组和阴性对照组,与正常子宫内膜间质细胞的GLO-ⅠmRNA表达量相当。GLO-Ⅰ主要在子宫内膜癌细胞浆中表达。结论GLO-Ⅰ在子宫内膜癌组织和细胞中呈过度表达,可能与子宫内膜癌的发生有关。第二部分子宫内膜癌组织GLO-Ⅰ酶活性目的了解GLO-Ⅰ在新鲜子宫内膜癌组织、癌旁组织、正常子宫内膜组织中酶活性。方法子宫内膜组织的新鲜标本均取自因子宫内膜癌或子宫肌瘤行子宫切除或因异常子宫出血(功能性子宫出血、子宫内膜息肉等)行诊断性刮宫的组织,包括正常子宫内膜、子宫内膜癌组织和癌旁组织。组织处理后按照Bradford方法进行蛋白质定量检测。用分光光度计检测样品GLO-Ⅰ酶活性。紫外分光光度计检测240nm吸光度。结果(1)应用分光光度计检测方法可以在新鲜正常子宫内膜、癌旁组织以及子宫内膜癌组织中检测出GLO-Ⅰ酶活性。(2)新鲜正常子宫内膜和子宫内膜癌旁组织GLO-Ⅰ酶活性弱表达,均＜2.0IU/mg;两组间GLO-Ⅰ酶活性无明显差异(P＞0.05)。(3)新鲜子宫内膜癌组织中GLO-Ⅰ酶活性异常高表达,均值达到92.3IU/mg,与正常子宫内膜组织比较,差异显著(P＜0.01)。结论子宫内膜癌组织GLO-Ⅰ活性异常升高;正常子宫内膜组织仅有微量GLO-Ⅰ活性。第三部分GLO-I对子宫内膜癌细胞增生和凋亡的影响目的探讨GLO-Ⅰ对子宫内膜癌细胞增生和凋亡的作用及可能机制方法针对GLO-ⅠmRNA序列设计了三条GLO-Ⅰ特异性的siRNAs和一条阴性对照(non-silencing)siRNA,用脂质体介导的方法将GLO-ⅠsiRNA转染入Ishikawa细胞,用RNAi抑制Ishikawa细胞中GLO-Ⅰ的表达。采用RT-PCR和Western blot检测干扰效果,MTT、流式细胞仪分别检测干扰前后细胞增生和细胞凋亡的变化。结果(1)转染GLO-ⅠsiRNA组、阴性对照组、空白对照组的Ishikawa细胞和正常子宫内膜间质细胞(ESC)中GLO-ⅠmRNA的表达相对值分别为0.25±0.06,0.93±0.10,1.0和0.33±0.05。干扰组与对照组比较,差异有显著性(均为P＜0.01)。干扰组GLO-ⅠmRNA的表达明显弱于阴性对照和空白对照组;空白对照组与阴性转染对照组比较,GLO-ⅠmRNA的表达无明显差异(P＞0.05)。(2)用IPP5.1软件进行条带灰度分析,以GLO-Ⅰ/GAPDH的比值代表其相对含量。设定空白对照组GLO-Ⅰ蛋白表达量值为1,ESC细胞组GLO-Ⅰ蛋白表达量值为0;阴性对照组为0.94±0.13:而干扰组GLO-Ⅰ蛋白表达水平为0.38±0.06,明显低于阴性对照组和空白对照组。干扰组与对照组比较,差异有显著性(均为P＜0.01)。阴性对照组和空白对照组比较,GLO-Ⅰ蛋白的表达无明显差异(P＞0.05)。(3)干扰GLO-Ⅰ基因表达,可以显著降低Ishikawa的增生能力。(4)RNA干扰后Ishikawa细胞凋亡明显增加,细胞凋亡率从5.31±1.15%%增加至50.9±2.83%。干扰组的细胞凋亡率(50.9±2.83%)与阴性对照(5.31±1.15%)和空白对照组(4.76±1.37%)相比,差异显著(均为P＜0.01)。结论RNAi技术可有效抑制子宫内膜癌细胞GLO-Ⅰ的表达。GLO-Ⅰ可促进子宫内膜癌细胞的增生,抑制其凋亡。其机制可能是:GLO-Ⅰ过度表达后大量分解其主要代谢底物MG,后者是重要的抑细胞素,可促进细胞凋亡;因此,细胞凋亡过程受到抑制,促发子宫内膜细胞异常增生。综上所述,GLO-Ⅰ在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜组织。GLO-Ⅰ在子宫内膜癌Ishikawa细胞中高度表达;正常子宫内膜间质细胞ESC中GLO-ⅠmRNA微量表达,蛋白表达阴性。GLO-Ⅰ蛋白表达于子宫内膜癌细胞浆。新鲜子宫内膜癌组织中GLO-Ⅰ酶活性异常升高,正常子宫内膜组织中GLO-Ⅰ酶活性仅微量表达。应用RNA干扰技术能够特异并有效地抑制子宫内膜癌细胞中GLO-Ⅰ的表达。RNA干扰抑制GLO-Ⅰ的表达可以抑制子宫内膜癌细胞的增生,并促进其凋亡,其机制可能是在细胞代谢水平通过酶解“抑细胞素”MG,使细胞凋亡过程受到抑制,从而促进细胞的异常增生。GLO-Ⅰ是子宫内膜细胞代谢水平中关键的“促细胞素”,GLO-Ⅰ在正常子宫内膜中的微量表达可能在维持子宫内膜细胞的正常凋亡和代谢方面有一定作用。GLO-Ⅰ的异常高表达在子宫内膜的恶性转化中可能起重要作用。GLO-Ⅰ在子宫内膜癌组织和细胞中的发现,为子宫内膜癌的发病机制研究提供了新的视角。为研究新的预防或治疗子宫内膜癌的方法提供了特异性的靶点,值得进一步深入研究。