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研究背景Akt,也称为蛋白激酶B(PKB),是哺乳动物丝氨酸/苏氨酸特定蛋白激酶的家族成员,包括Akt1,Akt2、Akt3三种亚型。Akt对诸多生理过程都具有重要的调节作用。既往研究发现Akt1基因敲除(Akt1-KO)小鼠生长迟缓;Akt3基因敲除(Akt3-KO)小鼠空间学习记忆能力受损。但是有关Akt3缺失损害空间认知的机制迄今还不清楚。海马CA1区频率依赖性长时程增强(LTP)诱导被认为是学习和记忆功能的细胞模型。按照高频刺激后兴奋性突触后膜电位(EPSP)斜率增加的时间又可以把LTP分为早期-LTP(细胞内激酶活性机制)和晚期-LTP(棘突内蛋白合成机制)。前者可能与AMPA受体(AMPAr)亚基Glu A1和Glu A2的磷酸化增强有关,而后者可能与AMPA受体等多种膜蛋白合成增加有关。有研究发现,m TOR抑制剂雷帕霉素的使用能阻止晚期-LTP的产生,但不影响早期-LTP的诱导。由于Akt3的缺失能减少m TOR的磷酸化水平,而Akt1的缺失不影响m TOR的磷酸化水平,因此本课题提出“Akt3缺失通过抑制m TOR-p70S6k信号通路,影响蛋白合成依赖性LTP的产生,导致认知障碍”的科研假设。研究目的1.探讨Akt1和Akt3缺失对小鼠空间认知和海马突触可塑性的影响。2.明确Akt1和Akt3缺失影响海马突触可塑性的分子机制。材料与方法1.Akt基因敲除小鼠由南京大学模式动物中心的陈贵泉教授赠送。用PCR方法鉴定Akt1基因敲除小鼠(Akt1-KO小鼠)和Akt3基因敲除小鼠(Akt3-KO小鼠)。Akt1-KO小鼠的野生型(WT)同窝小鼠被称为Akt1-WT小鼠。Akt3-KO小鼠的野生型(WT)同窝小鼠被称为Akt3-WT小鼠。本课题使用12周龄的Akt1-KO小鼠、Akt1-WT小鼠、Akt3-KO小鼠和Akt3-WT小鼠。2.认知行为检测试验:用开场试验检测小鼠的自发性活动;用Y-迷宫和Morris水迷宫试验检查小鼠的空间认知记忆功能。3.用甲苯胺蓝染色观察海马CA1区的组织结构和锥体细胞。4.采用场电位记录海马CA区的谢弗侧枝-CA1突触传递功能和突触可塑性LTP的诱导。用100Hz的高频刺激(HFS)诱导LTP。采用一次性HFS(HFS×1)和连续4次HFS(HFS×4,间隔5分钟)的方式。高频刺激后60分钟记录视为早期-LTP,180分钟记录视为晚期-LTP。5.用免疫印迹分析法检测海马脑区的Ca MKII、ERK1/2、m TOR、p70S6k、4EBP2和e IF4E的磷酸化水平和蛋白水平,AMPA受体亚基Glu R1和Glu R2的蛋白水平。第一部分试验结果1.开场实验(OFT)中,Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠的总行程无显著性差异。与Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠的总行程也没有发生改变。2.Y-迷宫试验结果显示,与Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠有较低的交替率,但没有统计学差异。与Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠的交替率也没有改变。与Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠在Y-迷宫试验的进臂次数都没有显着差异。3.Morris水迷宫任务结果显示,在训练第1-2天的明台试验中,Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠寻找可视平台的潜伏期没有差异。同样,Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠的明台试验潜伏期也没有差异。在训练第3-7天的暗台试验中,Akt3-KO小鼠寻找到暗台的潜伏期较Akt3-WT小鼠明显延长,但是Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠在暗台试验中的登台潜伏期并没有差异。在第8天的轨迹试验中,与Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠在平台象限的游泳时间,以及穿梭和停留时间都明显减少。但是Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠在轨迹试验的平台象限游泳时间没有差异。与Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠在Morris水迷宫中的游泳速度都没有显着差异。4.与Akt3-WT小鼠、Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠脑的总量减轻,但是海马结构没有明显异常,海马CA1区锥体细胞的密度未见显著性差异。5.与Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,刺激谢弗侧枝记录到CA1区兴奋性突触后电位(EPSP)的斜率在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠都没有明显改变。同样,双脉冲刺激诱导的双脉冲易化(PPF)比率在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠也未见差异。6.在Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠,HFS×1条件刺激能诱导早期-LTP。Akt1-KO小鼠早期-LTP的幅值要略低于Akt1-WT小鼠。NMDA受体拮抗剂MK801能阻断Akt3-WT小鼠和Akt3-KO小鼠早期-LTP的诱导。7.在Akt1-KO小鼠,HFS×4条件刺激可以诱导晚期-LTP,但是晚期-LTP幅值低于Akt1-WT小鼠。在Akt3-KO小鼠,HFS×4条件刺激不能诱导晚期-LTP。在Akt3-WT小鼠,MK801不能阻断晚期-LTP诱导,而m TOR抑制剂雷帕霉素能阻断晚期-LTP诱导。第二部分试验结果1.与Akt3-WT小鼠或Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠海马Ca MKII和ERK2磷酸化水平和蛋白水平都没有明显差异。在HFS×1刺激5分钟后,Akt3-WT小鼠、Akt1-WT小鼠、Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠Ca MKII和ERK2磷酸化水平都有明显增加,但是Akt1-KO小鼠的增加幅值明显低于Akt1-WT小鼠。此外,MK801能阻断HFS×1诱导Ca MKII和ERK2磷酸化增加。2.在HFS×4刺激5分钟后,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠Ca MKII和ERK2磷酸化的增加幅值与Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比没有差异。3.与Akt3-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠基础m TOR磷酸化或者HFS×1刺激5分钟后m TOR磷酸化水平都明显降低,而m TOR蛋白水平没有明显改变。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的m TOR磷酸化水平,但是不增加Akt3-KO小鼠的。PI3K抑制剂LY294002能阻断HFS×4诱导m TOR磷酸化水平增加。与Akt1-WT小鼠相比,Akt1-KO小鼠基础m TOR磷酸化,HFS×1和HFS×4刺激后的m TOR磷酸化水平,以及m TOR蛋白水平都没有明显改变。4.与Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠的基础p70s6k磷酸化、HFS×1刺激5分钟后的p70s6k磷酸化水平都没有明显改变。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的p70s6k磷酸化水平,但是不增加Akt3-KO小鼠的。LY294002能阻断HFS×4诱导p70s6k磷酸化水平增加。与Akt3-WT小鼠和Akt1-WT小鼠相比,Akt3-KO小鼠和Akt1-KO小鼠的基础4EBP2和e IF4E磷酸化,HFS×1刺激5分钟后的4EBP2和e IF4E磷酸化水平都没有明显改变。HFS×4刺激可以增加Akt3-WT小鼠的4EBP2和e IF4E磷酸化,但是不影响Akt3-KO小鼠的4EBP2和e IF4E磷酸化水平。LY294002和雷帕霉素能阻断HFS×4诱导4EBP2和e IF4E磷酸化增加。5.HFS×4刺激后180分钟后,在Akt3-WT小鼠,Akt1-WT小鼠和Akt1-KO小鼠AMPA受体亚基Glu R1和Glu R2的蛋白水平显著增加,但是在Akt3-KO小鼠没有增加。结论Akt3缺失通过阻止高频刺激激活海马神经元m TOR-p70S6k信号通路,抑制4EBPs和e IF4E磷酸化启动AMAP受体等棘突蛋白合成,损害晚期-LTP产生,导致认知功能减退。