间斑寇蛛亦称黑寡妇蜘蛛,是一种体型中等的蜘蛛,属于动物界、节肢动物门、蛛形纲、蛛形目、球腹蛛科、寇蛛属。间斑寇蛛是世界上迄今为止发现的最毒的蜘蛛之一。频繁报道的间斑寇蛛伤人事件,使得间斑寇蛛受到相关研究工作者越来越多的关注。一些早期研究包括我们的前期工作较为系统地探究了其毒腺分泌的毒液的性质和部分有毒蛋白的结构与功能。有趣的是,与其它有毒动物不同,间斑寇蛛的有毒成分不仅存在于毒腺中,而且还存在于身体的其它部位如腿和腹部组织,甚至卵粒和幼蛛体内也存在毒性成分。尽管间斑寇蛛卵粒已被证明含有丰富的生物活性成分,这些活性成分在神经生物学和药学等研究中显示出良好研究价值和应用前景,但到目前为止,只有一些相关研究的零星报道,缺乏系统的关于间斑寇蛛卵粒毒性的研究报道,没有实现对间斑寇蛛卵粒活性蛋白的完全分离纯化和结构与性质研究。研究中采用重复研磨和低离子强度的缓冲液或去离子水重复提取的方法制备间斑寇蛛卵粒提取物,然后利用截留分子量10000的超滤管将提取物分为分子量10000以上和以下的两部分。利用离体小鼠膈神经-膈肌标本分别检测两部分的神经毒性。结果表明,提取物的大分子组分表现出较强的毒性。为了研究卵粒蛋白与毒性作用的可能关系,运用蛋白质组学的策略研究了卵粒的蛋白质组成,并与间斑寇蛛的毒腺蛋白质组成做了比较。SDS-PAGE分析显示间斑寇蛛卵粒蛋白主要分布在分子量大于55 kDa以及34 kDa附近的区域。利用基于CapLC-MS/MS的方法从卵粒提取物中共鉴定到157个卵粒蛋白。生物信息学分析表明,这些卵粒蛋白参与许多重要的细胞功能和代谢过程,包括催化作用,转运作用,新陈代谢调控等。通过比较发现,卵粒的蛋白质组成比毒腺毒液的蛋白质组成更为复杂,它们之间的相似性很小;研究中没有从卵粒提取物中鉴定到典型的间斑寇蛛毒液蛋白latrotoxins和其他已知的毒液蛋白类毒素成分,说明卵粒具有与毒腺毒液不同的独特毒性机制。为了更为详细地研究间斑寇蛛卵粒中的活性蛋白,本研究综合运用多种生物化学技术对卵粒中的蛋白质成分进行了分离纯化和初步的结构与功能分析。利用凝胶过滤与离子交换色谱相结合的方法,从卵粒中分离纯化出一种毒性蛋白。利用电喷雾质谱测定它的分子量为23.752 kDa。腹腔注射时能使小鼠产生一系列中毒症状。电生理实验表明,该蛋白质能以可逆的方式完全阻断离体小鼠膈神经-膈肌标本的膈神经肌肉传导,提示该蛋白质具有较强的哺乳动物毒性。由Edman降解鉴定该蛋白质的N-末端的序列为N-S-I-A-D-D-R-Y-R-W-P-G-Y-P-G-A-G-L-I-P-Y-I-I-D-S—。利用该序列运用 Mascot 序列搜寻引擎搜索NCBInr蛋白质数据库的结果表明,蛋白质数据库中没有与之匹配的蛋白质。同时,BLAST分析表明,没有发现具有显著相似性的蛋白质。这些结果证明,该蛋白质（命名为Latroeggtoxin-I）是从间斑寇蛛卵粒中分离纯化的一种新型毒性蛋白质。运用凝胶过滤、离子交换色谱与反相色谱相结合的方法,从卵粒中分离纯化得到了另一种新型毒性蛋白质（命名为Latroeggtoxin-II）。电喷雾质谱测定该蛋白质的分子量为28.690 kDa。Edman降解法测得该蛋白质的N-末端序列为 E-S-I-Q-T-S-T-Y-V-P-N-T-P-N-Q-K-F-D-Y-E-V-G-K-D-Y—。禾利用多种蛋白质组学策略,证明该蛋白质与现有的蛋白质数据库中的蛋白质仅有极小的相似性,表明该蛋白质是从间斑寇蛛卵粒中纯化的一种新型毒素蛋白质。将Latroeggtoxin-II通过腹腔注射小鼠和蜚蠊,可以使实验动物特别是蜚蠊显示一系列的中毒症状。电生理实验表明,该蛋白质可以选择性抑制大鼠背神经节神经元的TTX-R型钠离子通道电流,在神经生理学研究和1临床药物及杀虫剂研制方面显示出的一定的应用前景。鉴于生物膜特别是质膜是非常重要的亚细胞结构,涉及多种细胞功能,本研究中我们还运用蛋白质组学技术对间斑寇蛛卵粒的卵壳膜蛋白进行了初步的分析并开展了相关的方法学研究。将上述制备卵粒提取物后的不溶部分充分洗涤后,利用含去垢剂的提取液进行蛋白质提取。提取的蛋白质混合物经SDS-PAGE分离、酶解和质谱分析后共鉴定出26个非冗余蛋白。这些蛋白质大多为推断的蛋白质或功能未知的蛋白质,少数具有酶活性或其它功能。推测间斑寇蛛卵粒的卵壳蛋白组成与功能具有其特殊性,相关研究有待进一步深入。目前,膜蛋白的研究已经落后于可溶性蛋白的研究,主要原因之一是大多数膜蛋白特别是整合膜蛋白或与脂膜结合紧密的膜蛋白往往具有较强的疏水性,给膜蛋白的溶解、酶解及鉴定产生不利的影响。为了增强膜蛋白溶解性,提高抽提效果,一般在起始缓冲液中添加去垢剂。鉴于大多数去垢剂会干扰后续的分析步骤,如何将去垢剂从样品特别是微量样品中去除是一个值得探讨的课题。在本研究中,我们利用富集的大鼠肝细胞膜片样品为模式材料,建立了一种PVDF膜介导的适用于微量膜蛋白样品分析的样品制备新方法。先用约2%SDS溶液提取膜片中的蛋白质,然后将蛋白质溶液涂在一片经事先激活处理的PVDF膜上,凉干后反复洗涤,以去除SDS和其他盐类。定量测定结果表明,样品中大约84%的SDS被去除而蛋白质的损失远小于10%。使用四种方法酶解吸附在PVDF膜上的蛋白质,并对四种方法的酶解效果进行了比较。蛋白质鉴定结果显示,二甲基甲酰胺（DMF）辅助的酶解对膜蛋白特别是高疏水性多跨膜区膜蛋白的鉴定是最有效的。上述结果表明,PVDF膜介导的样品净化结合DMF辅助的酶解策略在膜蛋白尤其是微量膜蛋白样品分析中具有重要的应用价值。