神经病理性疼痛是最常见的难治性疼痛。神经病理性疼痛现有治疗措施主要为镇痛药物，缺乏针对发病机制的治疗手段。在神经病理性疼痛的初始阶段脊髓小胶质细胞功能朝着“促炎”的方向发展，活化小胶质细胞合成和释放多种炎症细胞因子、一氧化氮、趋化因子、兴奋性氨基酸等等，激活更多小胶质细胞、星形胶质细胞和神经细胞，各种细胞之间形成相互影响的信号传递网络，启动疼痛信号传递“瀑布”效应。早期小胶质细胞的活化途径可能成为阻止神经病理性疼痛发生的靶点。　　乌司他丁是一种广谱的蛋白酶抑制剂，乌司他丁临床常用于治疗炎症因子过度释放、细胞溶酶体功能亢进或者膜破裂后水解酶外溢的疾病，如：脓毒症、全身炎症反应综合征、严重创伤、体外循环、急性胰腺炎等。乌司他丁在体内分解形成的低分子量成分对各种蛋白酶、水解酶均具有很强的抑制效应。在颅脑外伤、缺血性脑损伤时使用乌司他丁具有神经保护作用。研究提示乌司他丁也对神经病理性疼痛有治疗作用，但乌司他丁用于防治神经病理性疼痛的效果、具体机制、剂量范围缺乏充分的实验依据。　　ATP（三磷酸腺苷）以及其嘌呤受体是神经元和小胶质细胞间相互作用的重要信号通路，嘌呤受体亚型调节剂成为疼痛治疗新药开发的热点。在神经系统炎症或损伤时，小胶质细胞内ATP蓄积并通过囊泡等特殊形式释放到细胞外。excATP（细胞外三磷酸腺苷，extracellular adenosine triphosphate）与神经细胞或胶质细胞膜表面的嘌呤受体结合成为ATP致痛的基础。excATP和其它一些细胞因子激活小胶质细胞，上调P2Y受体表达水平，是神经病理性疼痛发展的重要推动力。研究结果提示在病理状态下 P2Y2 受体（P2Y2R）表达于神经细胞和胶质细胞，发挥不同的生物学效应。但小胶质细胞 P2Y2R 表达变化和在神经病理性疼痛发病机制中扮演的角色缺乏相关研究结果。小胶质细胞上的P2Y12R与小胶质细胞活化后神经递质和促炎性细胞因子释放有关，小胶质细胞P2Y12R的众多研究强烈提示，阻止P2Y12R激活可能成为神经病理性疼痛的防治新途径。　　AMPK（磷酸腺苷活化蛋白激酶，Adenosine monophosphate-activated protein kinase）在炎症因子刺激或应激反应时AMPK激活，促进更多的ATP合成和释放。AMPK已被证明与一些重要的细胞事件（如：炎症）有关。我们课题组研究发现，AMPK参与了细胞外ADP引起的星形胶质细胞内外ATP蓄积过程，鞘内注入AMPK特异性阻断剂（Compound C）可以显著抑制CCI（chronic contracted sciatic nerve injury，坐骨神经慢性压迫损伤）大鼠患侧脊髓背角的星形胶质细胞活化和大鼠的痛觉敏感化程度。AMPK 是否在小胶质细胞活化及抑制神经病理性疼痛形成中具有调节作用需要进一步的研究。　　本实验以CCI模型大鼠和培养小胶质细胞为研究对象，以早期活化的小胶质细胞主导的ATP致痛为研究重点，观察P2Y受体、AMPK、NF-κB与ATP和细胞因子的变化，用不同剂量的乌司他丁进行干预，探索其对神经病理性疼痛的治疗作用和机制。通过本研究可以初步阐明乌司他丁对神经病理性疼痛过程中小胶质细胞活化和 ATP致痛的作用和机制，为乌司他丁的临床应用提供实验依据。　　结果　　第一部分：　　1. CCI大鼠结扎后肢体的机械痛阈和热痛阈随着观察时间延长逐渐下降，以14d时为最低。14d时乌司他丁能显著改善CCI模型大鼠机械痛阈和热痛阈，其中4000U和8000U组机械痛阈和热痛阈提高均较明显。　　2. CCI组大鼠脑脊液中ATP、IL-1β、TNF-α浓度显著升高，在乌司他丁4000U和8000U组，大鼠脑脊液中ATP、IL-1β、TNF-α浓度较CCI组明显降低。　　3. 在CCI组脊髓背角iba1（小胶质细胞活化的标记蛋白）阳性的小胶质细胞明显增多。乌司他丁治疗组脊髓背角iba1阳性的小胶质细胞数随乌司他丁剂量增加逐渐减少，其中8000U组减少最明显。　　4. CCI组大鼠脊髓背角P2Y2R、P2Y12R的表达显著升高，其中在iba1阳性的小胶质细胞中表达也显著升高。乌司他丁4000U和8000U组P2Y2R、P2Y12R表达水平较CCI组明显降低。　　5. CCI大鼠脊髓背角的AMPK和NF-κB/P65表达水平较对照组明显升高，乌司他丁治疗组AMPK 表达水平呈剂量依赖性下降，其中8000U组最低。三个剂量组CCI大鼠脊髓背角NF-κB/P65表达均较CCI组明显下降。　　第二部分：　　1. 乌司他丁抑制LPS对小胶质细胞的促活化和促增殖效应。乌司他丁四个剂量组（100、500、1000、2000U /ml）中，1000、2000U/ml组对LPS促增殖效应的抑制作用最为明显。乌司他丁处理（500、1000U、2000U）后剂量依赖性的抑制iba1的表达 。但是，2000U /ml组小胶质细胞的轮廓模糊，部分细胞碎裂，故后续实验选择1000U/ml为实验浓度。　　2. 乌司他丁显著降低LPS引起的小胶质细胞内或excATP水平。乌司他丁显著抑制LPS处理后小胶质细胞释放IL-1β。乌司他丁显著抑制ATP、LPS处理后小胶质细胞释放 TNF-α。乌司他丁对 ATP 干预组小胶质细胞活化和 ATP、细胞因子释放的抑制效应与Suramin（苏拉明、P2Y阻断剂）相似。　　3. ATP、LPS促进小胶质细胞中P2Y2R、P2Y12R、AMPK、NF-κB/P65的表达。乌司他丁抑制ATP、LPS引起的小胶质细胞中P2Y2R、P2Y12R、AMPK表达上调， NF-κB/P65的增多和核转位。乌司他丁对ATP干预组小胶质细胞P2Y2R、AMPK表达的抑制效应与Suramin相似，对P2Y12R、NF-κB/P65表达的抑制效应较Suramin明显。活化小胶质细胞中AMPK表达变化与excATP浓度变化趋势一致。　　结论：　　1. 乌司他丁能显著抑制CCI大鼠脊髓背角小胶质细胞的激活以及LPS和ATP诱导的小胶质细胞活化和增殖。　　2. 外周神经损伤早期活化的小胶质细胞是脊髓增多的excATP主要来源。ATP激活小胶质细胞后引起的IL-1β、TNF-α释放增多，是ATP致痛的重要机制。　　3. 乌司他丁能减少致痛因子ATP、炎症因子（IL-1β、TNF-α）释放，并减少ATP在活化小胶质细胞中的蓄积，改变小胶质细胞活化功能状态。　　4. 外周神经损伤早期脊髓背角小胶质细胞表达上调的P2Y2R、P2Y12R与增多的excATP共同参与了早期神经病理性疼痛的发生。乌司他丁抑制P2Y2R、P2Y12R表达过程中的关键分子可能是NF-κB。　　5. AMPK通路的激活导致excATP持续增多是神经病理性疼痛初期疼痛持续和加重的重要机制。P2Y受体可能是AMPK表达增多的上游信号途径。乌司他丁减少ATP蓄积和释放的主要机制可能是调节AMPK通路功能状态。　　6. 早期应用乌司他丁能改善CCI大鼠神经病理性疼痛。　　外周神经损伤早期，脊髓小胶质细胞ATP/P2YR、AMPK通路活化是神经病理性疼痛重要发病机制。乌司他丁作用于小胶质细胞发挥抗炎、减少ATP蓄积和释放、阻止疼痛信号传递、减少下游信号通路（P2Y2、P2Y12、AMPK、NF-kB）启动的作用，预示了乌司他丁在神经病理性疼痛领域具有潜在的临床应用前景。