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目的:脑缺血性疾病严重危害着人类健康，其死亡率及致残率极高。研制有效的防治药物，提高神经元对缺血性损害的抵抗力，是此类疾病治疗上的一个重要策略。硫化氢（H2S）是继一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）后发现的体内第三种内源性气体信号分子，胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-1yase,CSE）、胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase,CBS）和3巯基丙酮酸转硫酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3MST）是哺乳动物组织中内源性H2S的主要合酶。大量研究证实H2S不仅在心血管系统发挥重要作用，作为中枢神经系统重要的神经调质，也参与了多种神经系统疾病的发生和发展。ATP敏感钾通道（ATP-sensitive potassium channels,KATP）是H2S作用在心血管系统的主要靶点之一。KATP通道广泛分布于中枢神经系统，并且在缺血缺氧性脑损伤中发挥保护作用。但是内源性H2S是否参与脑缺血保护作用以及全脑缺血前外源性给予NaHS是否可起到保护作用，其作用是否通过KATP通道的介导，有待于进一步研究。此外，在缺血性脑损伤的研究中，建立一个稳定、可靠的大鼠全脑缺血模型对实验研究至关重要。所以本研究首先对全脑缺血模型两种不同的造模方法进行比较，并选择成功率高、死亡率低的模型进行后期实验。在此全脑缺血模型的基础上，观察外源性H2S是否对脑缺血损伤有保护作用，并且进一步观察在此过程中KATP通道的两个亚基Kir6.1和SUR2B蛋白表达的变化，从而明确KATP通道是否参与了H2S的脑缺血保护作用。为临床脑缺血性疾病的防治提供理论依据。方法：健康雄性Wistar大鼠（280～320g）160只，随机分为以下三部分：1比较全脑缺血模型的两种不同的制作方法，并对其成功率、存活率进行评价具体分组如下：①传统模型组（n=30）：采用传统四血管阻塞法（four-vessel occlusion,4-VO）法制作大鼠全脑缺血模型；②直视模型组（n=30）：采用解剖显微镜直视下制作大鼠全脑缺血模型。两组大鼠首先采用传统的盲烙和镜下直视两种方法凝闭双侧椎动脉，48h后再夹闭双侧颈总动脉8min以造成损伤性全脑缺血（insult ischemia, II），然后恢复血流灌注。术后记录两组大鼠出现偏瘫或血尿的动物数，记录术中及术后死亡的动物数。并于末次缺血后7天，取海马脑组织制作石蜡切片，硫堇染色进行神经病理学评价。以全脑缺血后7天时海马CA1区神经元几乎全部死亡（delay neuronal death, DND）者为判定模型成功的标准，记录各组模型成功的动物数。2NaHS预处理对全脑缺血大鼠海马CA1区锥体神经元的保护作用采用第一部分中成功率高、死亡率低的造模方法来建立大鼠全脑缺血模型，观察不同给药时间、不同给药途径以及不同剂量的NaHS对大鼠8min全脑缺血造成的海马CA1区的锥体神经元DND的影响。分组:将40只雄性Wistar大鼠随机分为以下各组（每组n=5）:①sham组:只凝闭双侧椎动脉，但不进行8min全脑缺血。②II组:永久凝闭双侧椎动脉，48h后夹闭双侧颈总动脉8min致全脑缺血，然后恢复血流再灌注。③NaHS侧脑室注射+II组:在脑缺血前，采用侧脑室给药的方式给予NaHS。按照给药浓度的不同，进一步分为1-4四个亚组（表1）。④NaHS腹腔注射+II组:在脑缺血前，采用腹腔注射的方式给予NaHS。按照给药剂量、给药时间点的不同，进一步分为两个亚组（表1）。表1NaHS在③、④组中的给药方式、给药剂量、给药时间点全脑缺血后第7天，将大鼠断头处死，常规脑组织切片（5μm），硫堇染色。在光镜下观察海马CA1区DND情况，确定组织学分级（histologicalgrade, HG:0级:无神经元死亡；I级：散在的神经元死亡；II级：成片的神经元死亡；III级：几乎全部的神经元死亡）和神经元密度（neuronaldensity, ND：计数海马CA1区每l mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均数作为神经元密度）。3NaHS预处理对大鼠全脑缺血再灌注过程中KATP通道的两个亚基SUR2B及Kir6.1蛋白表达的影响分组如下：①NaHS+II组（n=15）；②生理盐水（saline，SN）+II组（n=15）。根据取材时间不同各组又分为6h组、12h组、24h组三个亚组。NaHS+II组于夹闭双侧颈总动脉8min前30分钟和再灌注前即刻两个时间点分别腹腔注射NaHS14μmol/kg一次。SN+II组于对应时间点注射相应量生理盐水，其余步骤同①组。各组于末次缺血后于预定时间点取海马CA1区脑组织（每组n=5），应用Western blot法观察SUR2B蛋白及Kir6.1蛋白的表达。结果：1比较全脑缺血模型两种不同的制作方法，并对其成功率、存活率进行评价1.1大鼠存活率①传统模型组存活7天的大鼠为26只，存活率为86.7%（26/30）；②直视模型组存活7天的大鼠为28只，存活率为93.3%（28/30）。其中①传统模型组有2只动物出现偏瘫、2只动物出现血尿（Fig.2）。1.2大鼠的成功率以全脑缺血后7天时海马CA1区神经元几乎全部死亡为判定模型成功的标准。①组的成功率为60%（18/30）；②组成功率为80%（24/30）（Fig.2）。2NaHS预处理对全脑缺血大鼠海马CA1区锥体神经元的保护作用在sham组中，海马CA1区的锥体细胞为2-3层，排列整齐，细胞形态完整、边界清晰、尼氏小体丰富，胞核大而圆、核仁清晰。全脑缺血组大鼠海马CA1区的锥体细胞几乎全部死亡，与sham组相比，组织学分级（HG）显著增高，而神经元密度（ND）则显著降低（p<0.05）。与单纯II组相比，NaHS侧脑室给药+II组中的1组（2μM）、2组（20μM）与腹腔给药+II组的1组（14μmol/kg），大鼠海马CA1区组织形态基本一致，锥体神经元几乎全部死亡，与单纯II组相比，HG和ND无显著差异（p>0.05）。在NaHS侧脑室给药+II组中的3组（200μM），部分锥体细胞存活，与II组相比HG显著降低，而ND显著增高（p<0.05）。与II组相比，NaHS侧脑室给药+II组的4组（侧脑室给药2000μΜ，最高药物浓度）组织损伤加重，细胞缺失更加明显，与II组相比，ND进一步降低（p<0.05）。腹腔给药+II组中的2组（给予NaHS14μmol/kg两次）大部分神经元存活，与II组相比HG显著降低，而ND显著增高（p<0.05）。以上结果表明，全脑缺血前30min，侧脑室注射NaHS（200μM,10μl）以及在全脑缺血前30min和再灌注之前即刻，分两次腹腔注射NaHS（14μmol/kg）均可发挥脑缺血保护作用，但是在侧脑室注射NaHS（2000μM,10μl）则可加重脑缺血时的损伤。3NaHS预处理对大鼠全脑缺血损伤后海马CA1区SUR2B蛋白及Kir6.1蛋白表达的影响采用显微镜直视下制作大鼠全脑缺血模型，在全脑缺血前30min和再灌注之前即刻，分两次腹腔注射NaHS（14μmol/kg），应用Western blot法观察了全脑缺血后24h内不同时间点大鼠海马CA1区SUR2B蛋白和Kir6.1蛋白的表达变化。Western blot结果显示，生理盐水+II组与NaHS+II组经8min严重缺血打击后，两组SUR2B蛋白表达随着时间的延长均出现了表达的上调（p<0.05）；与生理盐水+II组相比，NaHS+II组SUR2B蛋白的表达在6h、12h无明显变化（p>0.05），但是在24h时间点明显上调（p<0.05）。上述结果表明NaHS预处理上调了全脑缺血后24h时间点SUR2B蛋白的表达。无论是生理盐水+II组还是NaHS+II组，Kir6.1蛋白的表达在全脑缺血打击后6h、12h随着时间的延长其蛋白表达无显著性变化（p>0.05），但各组在24h时间点其表达同前两个时间点相比均明显上调（p<0.05）。NaHS+II组同生理盐+II组相比，在各个时间点Kir6.1蛋白表达均无显著性差异（p>0.05）。上述结果表明，NaHS预处理不影响全脑缺血后6h、12h、24h时间点Kir6.1蛋白的表达。结论：1显微镜直视下凝闭双侧椎动脉制造全脑缺血模型可明显提高模型的存活率和成功率。2全脑缺血前30min和再灌注前即刻各腹腔注射NaHS（14μmol/kg）一次可以较好的保护海马CA1区神经元对抗8min缺血损伤。3NaHS预处理可以上调全脑缺血后24h时间点的SUR2B蛋白的表达。4NaHS预处理不影响全脑缺血后6h、12h、24h时间点Kir6.1蛋白的表达