猪链球菌(Streptococcus suis)不仅是猪主要的细菌性病原,同时也是一种重要的人畜共患病病原。临床上,脑膜炎是猪和人感染猪链球菌的主要症状之一,目前对其脑膜炎形成机制了解还十分有限。最近文献表明,细菌RNA结合蛋白不仅在细菌小RNA调控中发挥关键作用,影响细菌毒力,而且还参与调控细菌运动、生物被膜等,发挥重要生物学功能。通过建立小鼠蛛网膜下腔注射方法研究猪链球菌脑膜炎形成机制和筛选猪链球菌RNA结合蛋白,为深入揭示猪链球菌致病机制,防控该类疫病提供理论依据。1 生物被膜对猪链球菌脑膜炎形成的影响合适的动物模型对于研究猪链球菌脑膜炎机制至关重要。小鼠是研究猪链球菌感染的重要模型之一。目前,虽然猪链球菌小鼠感染模型主要有腹腔注射、鼻内腔接种以及静脉注射等,但是这些攻毒方式不适用于研究来自生物被膜的细胞外基质等细菌表面成分在脑膜炎中的作用。虽然脑池内注射可直接将病原成分直接递送到脑部,但该方法的注射位置不明确。通过建立小鼠蛛网膜下腔注射方法,研究猪链球菌生物被膜在导致脑膜炎过程中的作用。将一定数量的浮游态与被膜态细菌在前囱(颅骨冠状缝与矢状缝会合处)至喙3.5mm处通过蛛网膜下腔注射入小鼠脑部。通过观察脑部病理切片和分析脑膜炎相关细胞因子的表达情况,与浮游态攻毒组相比,发现感染被膜态细菌的小鼠可观察到更严重的脑膜炎症状,脑膜炎相关细胞因子的表达也明显增加,表明生物被膜在猪链球菌导致脑膜炎过程中发挥重要的作用。与其它感染途径相比,该方法具有明显的优势:它不仅可以用于评价菌体成分在脑部对宿主免疫应答产生的影响以及模拟猪链球菌入侵中枢系统;还可以用来研究其它细菌性病原引致脑膜炎,评价抗细菌性脑膜炎药物的治疗效果。2 MS2纯化技术筛选猪链球菌RNA结合蛋白有关细菌RNA结合蛋白的鉴定及功能研究在革兰氏阳性菌中报道很少。为建立理想的猪链球菌RNA结合蛋白筛选方法,本试验以该菌与毒力相关的两个小RNA rss04和rss06为研究对象,通过纯化MS2序列识别蛋白MS2-MBP,构建表达MS2融合 RNA(MS2-rss04 与 MS2-rss06)的质粒 pSET2-MS2-rss04、pSET2-MS2-rss06 及阴性对照质粒pSET2-MS2-negative,将上述质粒分别电转化至猪链球菌小RNA缺失株△rss04、△rss06及野生株P1/7,通过MS2.识别序列标签纯化,收集洗脱液,提取RNA和蛋白质。荧光定量检测表明,表达MS2融合RNA的样品rss04和rss06分别富集16倍和110倍,而阴性对照组未检测到rss04和rss06的富集,表明MS2识别序列纯化体系成功建立。收集的蛋白经过高效液相色谱-质谱分析,发现50个蛋白质只存在于表达融合RNA的样品中而不存在于对照组样品中,深入分析候选蛋白结构域,发现9个蛋白质存在RNA结合结构域,其中DNA结合反应调节子不仅具有RNA结合结构域,还具有与细菌毒力相关的OmpR蛋白结构域。上述研究为深入阐明猪链球菌小RNA功能,阐明小RNA调控毒力机制奠定基础。