近年来,我国对植物油的需求越来越大,自给率严重不足,2016年我国大豆进口超过8,000万吨,在当前和今后一段时间内我国将持续面临食用油短缺的严峻局面。花生油是我国主要的食用油之一,花生油脂肪酸配比合理、烟点高,在我国食用油消费中占比越来越大。花生油需求的增加导致对花生含油量和油脂品质的关注增加。据统计,花生含油量提高1%,相当于产量提高2%,企业效益可提高7%以上。常规花生品种的含油量大约为50%,高油花生品种可达55%以上,可见在花生含油量上还有较大提升空间。长期以来,花生育种主要关注产量,在花生含油量和油脂品质育种方面没有较大突破。因此,研究花生油脂合成相关基因及其调控机制,有助于通过分子育种培育高油、优质的花生新品种,对于缓解我国目前食用油危机具有重要意义。在油料作物中,油脂主要以三酰甘油(triacylgycerol,TAG)的形式贮存在种子中,二酰甘油酰基转移酶(DiacylgycerolAcyltransferase,DGAT)直接参与TAG 合成。DGAT 分为 DGAT1、DGAT2、DGAT3 和 WSD/DGAT 四个亚家族,其中DGAT1和DGAT2负责种子中大部分油脂的合成,是TAG合成的关键基因。DGAT1和DGAT2虽然都能合成TAG,但是它们具有不同的亚细胞定位和表达模式,没有功能冗余。目前对植物DGAT1和DGAT2的研究基本都是通过过量表达,来验证基因促进油脂合成增加的功能,而对于DGAT进化及其分子调控机制方面的研究鲜见报道。因此,本研究对花生中负责TAG合成的AhDGAT1和AhDGAT2进行系统研究,分析其遗传变异和进化,阐明其基因功能,揭示其分子调控机制,从而为高油花生育种和油脂品质改良奠定理论基础。1.植物DGAT家族的遗传变异和进化研究植物油脂合成过程复杂,涉及基因众多。为了解DGA4T基因的遗传变异与进化,选取30个物种检索DGAT的同源序列,并对这些序列做了进化分析。结果如下:(1)进化树分析。通过对30个物种中DGAT基因的检索分析,发现该家族基因在植物中广泛存在,是比较古老的基因。DGAT1、DGAT2和DGAT3的亲缘关系较近,而它们与WSD/DGAT的亲缘关系较远。DGAT家族的进化伴随着植物进化同步进行,DGAT亚家族分化早于植物进化。WSD/DGAT亚家族进化树中,第Ⅲ和Ⅳ分支比较特殊,它们只存在于高等双子叶植物。4个亚家族在进化中都发生基因加倍,这种只含有高等植物的分支可能是由谱系特异的基因加倍导致。(2)植物DGAT家族基因结构、表达模式、蛋白跨膜区和保守结构域分析。从30个物种中选取具有代表性的18个物种,对其DGAT家族基因进行具体分析,发现4个DGAT亚家族的特点明显不同。A.基因结构不同:DGAT1外显子数目多为15-16个,DGAT2多为8-9个,DGAT3多为2个,WSD/DGAT多为5-7个。B.跨膜区数量不同:DGAT1含有8-9个跨膜区,DGAT2含有1-4个跨膜区,DGAT3不含有跨膜区,而WSD/DGAT具有0-1个跨膜区。C.保守结构域不同:每个亚家族有自己特有的保守结构域。D.表达模式不同:在拟南芥和大豆中,DG4T1、DGAT2和DGAT3的表达范围较广,在种子中表达量较高;WSD/DGAT表达范围相对较窄,在种子中表达量较低。玉米中4个DGAT亚家族在各个组织都表达。这些差异表明他们在植物起源之前就具有不同的祖先,并且具有不同的进化历史。(3)植物DGAT家族可变剪接分析。可变剪接是真核生物中一种调控基因功能的重要方式。通过对18种植物DGAT基因的可变剪接分析,发现其可变剪接方式主要为内含子滞留、内含子3’-端可变剪接和5’-端可变剪接。DGATV发生可变剪接的位置和类型相对保守,而DGAT2不保守。WSD/DGAT在棉花、大豆和拟南芥中可变剪接位置与在二穗短柄草中存在明显差异。2.可变剪接调控花生DGAT1的功能研究从丰花1号花生品种中克隆了 7条AhDGAT1序列GhDGAT1.1-1.7),它们是AhDGAT1不同剪接体形式。这是首次在植物DGAT基因中发现存在可变剪接现象。为验证各个剪接异构体的功能及其调节作用,我们开展了四方面的研究:(1)表达模式分析。AhDGAT1.1-1.7分为两个亚型,AhDGAT1.1-1.3之间相似性为 98.4%,AhDGAT1.4-1.7之间相似性为 97.2%,其中 hDGAT1.2和AhDGAT1.4编码区提前终止。用Taqman探针荧光定量方法分析AhDGA4T1.1-1.7表达模式,结果显示7条4AhDGAT1序列的表达模式基本相似,都是在果针入土15 d和30 d的种子中表达量最高。各组织中AhDGAT1.1表达量显著高于AhDGAT1.2和AhDGAT71.3。除种子外的组织中,AhDGAT1.1在根中表达量最高,AhDGAT1.2在花中表达量最高。AhDGAT1.4只在叶和果针入土15 d的种子中表达,AhDGAT1.5-1.7在各个组织器官都表达。(2)利用TAG合成缺陷型酵母菌株H1246验证各个剪接异构体的功能。7个AhDGAT1序列在酵母H1246中过表达,AhDGAT1.2和AhDGAT1.4由于编码提前终止,不能恢复H1246合成TAG的能力,AhDGAT1.1、AhDGAT1.3和AhDGAT1.5-1.7转基因酵母油脂和脂肪酸含量提高3-5倍,其中AhDGAT1.5含量最高。AhDGAT1.1和AhDGAT1.5-1.7转基因酵母中C16:0、C16:1、C18:0和C18:1含量显著升高。(3)可变剪接对AhDGAT1功能的调节作用。为分析AhDGAT1.2和ADGAT1.4是否参与AhDGAT1其它剪接异构体的调控,我们构建了 5个双基因共表达载体:AhDGAT1.1+1.2、AhDGAT1.2+1.3和AhDGAT1.4+1.5/1.6/1.7,转化H1246菌株验证功能。每个转双基因酵母都具有合成TAG的能力,但是其油脂含量和脂肪酸组分与转单基因酵母相比发生变化。油脂和脂肪酸总量方面,AhDGAA71.1+1.2转基因酵母油脂和脂肪酸含量低于AhDGATV.1;AhDGAT1.2+1人3的含量高于AhDGAT1.3;AhDGAT1.4+1.5和AhDGAT1.4+1.6的含量低于AhDGAT1.5和AhDGAT1.6。脂肪酸组成方面,AhDGAT1.1+1.2转基因酵母的C16:0含量比例由17.5%下降到7.6%,AhDGAT1.4+1.5的C16:1含量比例由26.7%下降到0.8%,其C18:0含量比例由10.9%上升到22.9%,说明转双基因酵母的底物特异性发生变化。AhDGAT1.2和AhDGAT1.4虽然没有酰基转移酶功能,但是可以通过调节其它剪接异构体来发挥作用。(4)利用转基因烟草验证AhDGAT1的功能。将AhDGAT1.1在烟草中过表达,转基因烟草种子脂肪酸含量上升16.1%-23.5%,但油亚比(油酸/亚油酸)下降。3.AhDGAT2关键酶活性位点的挖掘研究表明植物DGAT2与特殊脂肪酸积累有关,如蓖麻酸和棕榈酸等,但是目前对影响DGAT2功能和底物特异性的关键酶活性位点了解很少。本实验室从11个花生品种中克隆了9个AhDGAT2序列(AhDGAT2a-i),发现不同序列之间存在9处氨基酸差异。为验证这些位点与酶活性之间的关联,设计9个位点的单点突变,验证其对酶活性的影响。结果如下:(1)AhDGAT2氨基酸位点单点突变体功能验证。9条AhDGAT2氨基酸序列存在9处差异(D3V、N6D、A9V、A26P、T37M、T107M、S118P、K251R、L316P)。以AhDGAT2a为基准进行单点突变,将AhDGAT2a及其突变序列转化酵母H1246,并进行油脂和脂肪酸含量检测。结果表明,与AhDGAT2a转基因酵母相比,N6D和A26P转基因酵母油脂含量分别上升16.4%和17.1%,脂肪酸含量分别上升35.6%和26.8%;而L316P油脂和脂肪酸含量与空载对照基本一致,表明其不具备TAG合成能力。突变体转基因酵母脂肪酸组成也发生变化,D3V和T107M脂肪酸中C18:0的含量比例下降24.8%和37.3%,N6D脂肪酸的C16:1含量比例升高46.8%,A26P脂肪酸中C16:0含量也上升显著。说明N6D和A26P突变导致AhDGAT2a酶活性升高,L316P突变导致酶活性消失,并且突变影响了AhDGAT2a的底物特异性。(2)利用转基因烟草验证AhDGAT2a的功能。在烟草中过表达AhDGAT2a,转基因烟草种子脂肪酸含量升高21.1%-26.9%,油亚比上升,叶片脂肪酸含量也有升高。含油量是数量性状,受多基因调控,各基因之间互相协调,共同决定油脂含量的高低。本论文系统研究了 AhDGAT1和AhDGAT2的功能及其调控方式,获得一些新发现:1.可变剪接对AhDGAT1亚家族基因的功能具有一定的调节作用。AhDGAT1可以通过产生不同剪接异构体来调节自身功能;2.鉴定了AhDGAT2中几个关键酶活性位点,其中N6D和A26P两个位点的突变使酶活性上升,而L316P位点突变后酶活性消失。本论文从一个新的角度揭示了花生油脂合成与调控的复杂性,是对植物油脂合成调控机制研究的有益补充,为花生高油育种与品质改良提供一定的理论支撑。