膜联蛋白(annexin)家族是在真核生物中广泛存在，具有重要生理功能的一类钙依赖性磷脂结合蛋白。因其在Ca2+存在的情况下能够和酸性磷脂结合，所以又称为钙依赖性磷脂结合蛋白。膜联蛋白B2(AnxB2)是本实验室从猪囊尾蚴cDNA文库中筛选得到的一个新的膜联蛋白B家族成员。它具有四个典型的annexin重复结构域，每个结构域包含一个"G-X-G-T-(38 residues)-D/E"基序，形成4个typeⅡ型Ca2+结合位点；经生物信息学分析可知，AnxB2分子结构中包含15个抗原表位；AnxB2在Ⅱ和Ⅲ结构域之间存在2个独特的“插入片段”和一个“赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)”序列并且AnxB2还具有一个独特的粘多糖附着位点(G-AS)。我们根据AnxB2已有的结构特征来研究AnxB2的生物功能，为AnxB2功能的进一步研究奠定基础。 本课题的研究分为三个方面： 1、从猪带绦虫六钩蚴中克隆出AnxB2基因，证明AnxB2在六钩蚴阶段表达。接着借助计算机同源模建技术构建了4个AnxB2突变体M234，M134，M124，M123。用基因重组技术将AnxB2及其突变体分别构建到真核表达载体pcDNA3.1中，并用阳离子脂质体介导的方法转染真核细胞，检测结果表明构建的真核质粒能够表达相应的目的蛋白；同时也构建了AnxB2突变体的原核表达载体并用亲和层析技术纯化相关蛋白。另外，利用膜联蛋白的钙依赖性磷脂结合活性构建的pJLA503-AnxB2表达载体使AnxB2在大肠杆菌中实现了高表达；接着采用钙离子介导的沉淀反应来初步纯化重组蛋白；随后用离子交换层析技术进一步纯化蛋白。用改良的纯化方法，我们制备出高纯度和高生物活性的AnxB2。 2、对AnxB2进行免疫学方面的研究。将真核表达质粒分别免疫BALB/c纯系鼠，以间接ELISA检测免疫小鼠血清的抗体应答水平；淋巴细胞增殖实验检测免疫动物CD4+T细胞的活化状态；淋巴细胞细胞因子试验检测免疫小鼠的细胞免疫应答水平。结果表明，免疫注射的DNA疫苗虽然均能诱导Th1型免疫应答反应，但是它们诱导机体产生的免疫应答水平不同：pcDNA3.1-M234组诱导的抗体水平最低和pcDNA3.1-M123组分泌的IFN-γ水平最低：“DNA prime-protein boost”组诱导的抗体水平和分泌的IFN-γ水平最高。根据结果，我们可以推断：M234缺失的抗原表位为B细胞表位，而M123缺失的表位是T细胞表位；“DNA prime-protein boost”策略可有效增强机体的特异性免疫应答。 3、对AnxB2进行抗凝血活性方面的研究。结果表明：AnxB2具有外源性抗凝血活性；与活化血小板结合的能力更强(versus AnxB1)。从结果我们可知，用改良的纯化方法制备的AnxB2保留了原来的生物活性，验证了这种纯化方法的可行性。随后对AnxB2突变体M123、M234进行抗凝血活性和免疫原性研究。结果表明，M234不仅较好的保留了野生型AnxB2的抗凝血活性，而且免疫原性降低，这为进一步研究膜联蛋白AnxB2的抗凝血功能和研制高效、低免疫原性的靶向溶栓剂奠定了基础。