研究背景类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,它会影响关节、结缔组织以及相关的骨骼和血管,并伴有全身的代谢和心理疾病的合并症。目前,RA的治疗药物可分为四大类:包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、皮质类固醇、非生物性病情缓解抗风湿药（DMARDs）和生物性DMARDs。然而,相当多的RA患者对上述药物的治疗并不耐受或出现不同程度的耐药,从而无法控制病情发展最终导致关节毁损。严重的类风湿性关节炎将通过关节置换等手术方案治疗,给病人身体、心理以及经济带来沉重负担。因此,寻找其它治疗RA的分子靶点和方法是目前治疗RA的一个巨大的挑战。在细胞疗法中,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）存在于骨髓、外周血、脂肪、滑膜和其他中胚层组织中,其具有分化成各种间充质谱系的能力,包括成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。此外,MSCs在调节T、B细胞的增殖和分化、树突状细胞的成熟和NK细胞的活性方面表现出强大的免疫抑制作用,已被应用于治疗多种自身免疫性疾病。目前,基因治疗为改善RA动物模型方面开辟了有趣的前景并取得了重大进展。环氧化酶（cyclooxygenase,COX）有两种亚型,包括介导生理功能的组成型COX-1和将花生四烯酸转化为前列腺素的诱导酶COX-2。COX-2在炎症发反应期对产生前列腺素E2（PGE2）起关键作用。转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）与多种风湿性和自身免疫性疾病有关。作为炎症反应的主要细胞因子,TGF-β促进T细胞分化,具有抑制和调节活性。在TGF-β的三种亚型中,TGF-β3通过增加基质沉积和促进软骨分化对MSCs表现出强烈的软骨形成作用。本研究利用组织工程和基因修饰的方法同时下调人骨髓间充质干细胞中的COX-2基因、过表达TGF-β3基因,经新型超顺氧化铁颗粒（Molday ION Rhodamine-BTM,MIRB）标记后移植入卵清蛋白诱导的类风湿关节炎（antigen-induced arthritis,AIA）模型关节腔内。进一步探究双基因双向调控的人骨髓间充质干细胞在类风湿关节炎中潜在的治疗效果。第一部分COX-2联合TGF-β3双基因双向调控、新型超顺磁性氧化铁颗粒标记人骨髓间充质干细胞定向分化能力的实验研究研究目的研究经COX-2基因沉默、TGF-β3基因过表达、新型超顺磁性氧化铁颗粒标记的人骨髓间充质干细胞定向分化能力的测定。研究方法1、利用组织工程原理,在人骨髓间充质干细胞中下调COX-2基因和过表达TGF-β3基因。2、采用实时荧光定量PCR检测双基因转染后人骨髓间充质干细胞中PGE2、SOX9、ACAN的mRNA表达水平,Western blot检测干细胞中COX-2和TGF-β3蛋白表达水平。3、选择MIRB标记双基因转染的人骨髓间充质干细胞并进行普鲁士蓝染色检测,分别通过油红O染色、茜素红S染色、阿利新蓝染色测定双基因转染后人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨的定向分化能力。研究结果1、在慢病毒转染48小时后通过荧光显微镜观察并计算病毒转效率。Lenti-shCOX-2在MOI=50时转染率约为90%,Lenti-TGF-β3在MOI=70时转染率约为80%。经慢病毒介导的双基因转染组hBMSCs有少数细胞漂浮死亡,但转染效率不受影响。2、经慢病毒转染后,通过PCR检测发现Lenti-shCOX-2和双基因共转染组的PGE2 mRNA水平显著降低（P＜0.01）。Lentit-TGF-β3和双基因共转染组SOX9、ACAN mRNA水平显著升高。利用Western blotting检测发现Lenti-shCOX-2和双基因共转染组COX-2蛋白表达的灰度值显著低于空白对照组（P＜0.05）。Lenti-TGF-β3及双基因共转染组TGF-β3蛋白水平显著升高（P＜0.05）。3、荧光显微镜显示慢病毒携带绿色荧光EGFP在细胞质和细胞核内表达。MIRB标记后,在细胞质中发现红色荧光。普鲁士蓝染色同时证明了细胞质内铁的存在。在成骨和软骨分化方面,MIRB标记的Lenti-TGF-β3和双基因转染组中钙结节密度和细胞外基质蓝色深染程度明显高于其他组。结论1、shCOX-2和TGF-β3基因可通过慢病毒介导高效转染人骨髓间充质干细胞。经慢病毒转染后人骨髓间充质干细胞中COX-2基因沉默、TGF-β3实现高表达。2、MIRB标记不影响转基因人骨髓间充质干细胞的定向分化能力,TGF-β3转染促进人骨髓间充质干细胞成骨和成软骨分化。第二部分关节腔内移植双基因双向调控的人骨髓间充质干细胞对卵清蛋白诱导的兔类风湿关节炎模型的治疗评估研究目的评估关节腔内移植COX-2基因沉默、TGF-β3基因过表达的人骨髓间充质干细胞对类风湿关节炎模型的治疗效果。研究方法1、利用卵清蛋白联合弗氏完全佐剂的方法构建卵清蛋白诱导型兔类风湿关节炎模型并进行评估。2、利用临床3.0 T核磁共振示踪动物模型膝关节内MIRB标记、双基因转染的人骨髓间充质干细胞。3、采用ELISA法测定血清、关节液中TNF-α、IL-1β、PGE2因子表达。4、手术切开膝关节宏观观察膝关节滑膜增生与软骨退变情况。5、将滑膜、髌下脂肪垫、关节囊组织进行普鲁士蓝染色与激光共聚焦显微镜观察。6、应用HE染色检测滑膜组织并进行滑膜形态学特征病理学评分。7、采用改良番红O-固绿染色及软骨改良Mankin’s评分对软骨进行病理学评价。8、采用Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及阳性面积占比评估治疗后的类风湿关节炎软骨变化情况。研究结果1、造模过程中发现Control组STS评分逐渐增高,其他各组在关节直径与STS评分方面均显著低于Control组。其中,COX-2基因沉默组和双基因转染组在治疗4周时关节直径与STS评分明显低于单纯干细胞治疗组和TGF-β3过表达组（P＜0.05）,4周后降低程度逐步减缓,8周后趋于稳定,COX-2基因沉默组和双基因转染组之间比较无统计学意义（P＞0.05）。2、在3.0TMRI GRE T2加权像下,关节内诱导1周后,各组兔右膝关节均出现不同程度的炎症表现,Control组在造模12周,可见关节内积液增多,滑膜重度增生,软骨严重破坏。双基因转染组在治疗4周后积液和滑膜增生情况明显改善。治疗后8周和12周的MR图像中仅见少量炎症表现,并且整个治疗过程中关节面光滑。3、采用ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α以及关节腔灌洗液中PGE2的表达。在治疗后4周,各组促炎细胞因子水平都出现了降低表现。12周时,双基因转染组血清和关节液中IL-1β、TNF-α和PGE-2蛋白表达水平明显下调。4、膝关节宏观观察,各干细胞移植组均可观察到关节髌下脂肪垫的棕黄色改变区域。治疗12周后双基因转染组表现出最好的结果,关节炎症反应不重,少量出血,关节结构基本完整,软骨表面光滑。5、与MRI检测结果相似,经普鲁士蓝染色和激光共聚焦观察,在增生的滑膜细胞层、纤维脂肪组织周围、增生的纤维细胞内以及髌下脂肪垫增生的纤维细胞内均发现铁颗粒的存在。6、滑膜HE染色及滑膜形态学特征评分显示双基因转染组在治疗后8周,炎症细胞基本消失殆尽,滑膜少量增生（P＜0.05）。12周时,双基因转染组仅观察到滑膜增生。在整个治疗过程中,双基因转染组滑膜组织病理学评分均低于COX-2基因沉默组（P＜0.05）。7、番红O固绿染色示双基因转染组在整个治疗过程中结构均完整,第8周基质染色、软骨细胞数量明显增多,12周基质深染,软骨细胞丰富且排列整齐,Mankin’s评分明显低于其他组（P＜0.01）。8、在免疫组化染色方面,12周时,双基因转染组软骨细胞和软骨基质中Ⅱ型胶原染色呈强阳性表达,阳性染色区百分比明显高于其他各组（P＜0.01）。结论1、MIRB标记的转基因干细胞可在3.0T MRI GRE T2加权像下实时监控并追踪干细胞的在膝关节内的迁移、聚集效应。2、移植后的转基因人骨髓间充质干细胞可以附着于滑膜及髌下脂肪垫内生存并发挥作用。3、COX-2联合TGFβ3基因共转染人骨髓间充质干细胞不仅可以明显减轻类风湿关节模型中滑膜炎症细胞的浸润和滑膜增生,而且具有早期保护关节软骨并促进软骨细胞及基质增生的作用。