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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)能引起世界范围内的淡水、海水鱼类及其它养殖动物发病,其病症为快速的爆发性败血症及组织损伤,病鱼在短期内死亡,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌W-1分离自山东莱州湾海区发病的鲈鱼,已有的研究表明,W-1胞外金属蛋白酶是其重要的毒力因子之一,在细菌致病过程中发挥了重要的作用。编码金属蛋白酶的empA基因已被克隆和测序。本研究将鳗弧菌W-1金属蛋白酶基因empA分别克隆到原核表达载体pBV220、pBAD24和pET24d(+)中,得到的三种重组质粒分别转化大肠杆菌JM109、TOP10和BL21(DE3)。比较empA基因在三种重组菌JM109/pBV220/empA、TOP10/pBAD24/empA和BL21(DE3)/pET24d(+)/empA中的表达情况,最终选择重组菌BL21(DE3)/pET24d(+)/empA来表达、纯化及定点突变研究empA基因。对重组菌培养及诱导条件进行优化后发现,25℃时经1 mM IPTG诱导重组菌体表达的EmpA金属蛋白酶可溶性蛋白表达量最多、包涵体形成最少,并且分泌到培养上清液中的EmpA金属蛋白酶量也最大;Western-blot检测重组表达的EmpA金属蛋白酶具有抗原性。进一步用Ni亲合柱从重组菌菌体及其培养上清液中纯化了EmpA金属蛋白酶,SDS-PAGE电泳测得分子量都为36 kDa,而未经加热处理的蛋白分子量为44.6 kDa;用Sephadex G-200测得蛋白分子量都为44.6 kDa,表明在大肠杆菌中表达的EmpA金属蛋白酶为单体蛋白。纯化的EmpA金属蛋白酶对牙鲆鳃细胞系(FG)有毒性作用,用5μg的蛋白作用于FG,在12 h内即可观察到细胞的死亡;酶对大菱鲆也表现出致死毒性,其症状与感染鳗弧菌的病鱼症状相似,半致死剂量LD50为8.1μg/鱼。利用PCR方法对推测的EmpA金属蛋白酶活性位点氨基酸的碱基序列进行了定点突变,将突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并用Ni亲合柱分别纯化了各突变蛋白。比较EmpA金属蛋白酶及其突变蛋白的蛋白水解活性和细胞毒性发现,突变蛋白都不同程度地丧失了其蛋白水解活性和细胞毒性,表明突变位点的氨基酸对酶活性起着十分重要的作用。将没有蛋白水解活性和细胞毒性的m-EmpA7蛋白的基因序列m-empA7克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,得到真核重组表达质粒pEGFP-N1/m-empA7。用磷酸钙共沉淀法将重组质粒转染至CHO和HEK293T细胞中,通过荧光显微镜、RT-PCR检测和Western-blot检测证实目的基因在真核细胞内获得了表达。对牙鲆肌肉注射50μg/尾的重组质粒pEGFP-N1/m-empA7,于接种后不同时间分别取对照组和试验组牙鲆各组织做冷冻切片,在荧光显微镜下观察可见,在试验组牙鲆的注射点周边肌肉、注射点对面体侧肌肉、脾脏、前肾、体肾、后肠、心、鳃和肝脏等部位均可见绿色荧光,对照组组织没有荧光。RT-PCR检测和Western-blot检测的结果也证实目的基因在牙鲆体内获得了表达。为研究真核重组表达质粒pEGFP-N1/m-empA7对牙鲆的免疫效果,分别以5μg/尾、20μg/尾和50μg/尾的不同剂量对牙鲆进行肌肉注射免疫,同时设置注射PBS和空质粒的对照组。ELISA检测结果显示,各免疫组牙鲆体内均产生了抗m-EmpA7抗原的特异性抗体,且抗体水平随接种剂量的增加而升高;而对照组牙鲆血清基本没有抗体凝集发生,在不同时间内抗体水平无明显变化。免疫后第5周,用鳗弧菌W-1对各组进行攻毒实验,各免疫组的免疫保护率(RPS)分别为57.1%,71.4%和85.7%,与对照组相比,免疫组产生了显著的保护作用(p < 0.001)。