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研究目的:辅助性T细胞17(Thelper 17,Th17)是一类表达转录因子RORyt并分泌白介素17(interleukin 17,IL-17)的CD4+T细胞亚群。Th17细胞是机体免疫防御重要免疫细胞,在机体清除外源性细菌和真菌感染发挥重要作用,同时参与炎症性疾病和多种自身免疫性疾病的发生发展。Th17细胞分化和功能调控机制复杂,相关研究表明细胞因子、转录因子、代谢因素如糖酵解途径和表观遗传等参与Th17细胞的分化调节。大量研究表明PI3K/Akt/mTOR是促进Th17细胞分化的关键信号通路,其通过上调核糖体蛋白S6激酶1/2(S6K1/2)磷酸化和表达,促进Th17细胞分化关键转录因子RORyt的核转位,调控Th17细胞分化。FK506结合蛋白51(FK506 bindingprotein 51,FKBP51)属于免疫亲和素家族成员,具有多种生物学功能。FKBP51作为支架蛋白,促进磷酸酶PHLPP和AKT结合,介导Akt的去磷酸化,抑制AKT信号通路活性。我们前期研究发现FKBP5(c.163G>C,p.Va155Leu)基因突变与佩吉特骨病(Paget’s disease ofbone,PDB)相关,研究表明FKBP51V55L突变促进了 AKT信号通路活化,从而促进破骨细胞增殖和活化。但FKBP51及其突变对Th17分化的调控作用不清楚。本文以FKBP51V55L突变和FKBP51敲除(FKBP51ko)CD4+T细胞为模型,研究FKBP51对Th17细胞分化的调节作用,阐明其对Th17细胞分化调控机制,为Th17细胞相关自身免疫病诊疗新靶点的发现提供实验依据。研究方法:1.基因修饰小鼠的鉴定:FKBP51V55L基因突变小鼠和FKBP51基因敲除小鼠由本室饲养繁殖。剪取鼠尾2-3mm,用鼠尾裂解液裂解提取DNA,FKBP51V55L突变引物和FKBP51KO引物(引物序列见实验材料部分)行PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳,鉴定小鼠基因型。2.CD4+T细胞分离纯化:取小鼠脾,制备单细胞悬液,利用磁珠分选方法分离纯化CD4+T细胞,用于后续体外诱导分化实验。3.Th17细胞诱导分化:CD4+T细胞悬浮于Th17细胞诱导分化培养基,细胞浓度为2× 106细胞/2ml/孔,接种于抗小鼠CD3抗体包被6孔细胞培养板中,37℃,5%CO2浓度的细胞培养箱内诱导分化5天。4.流式细胞术:通过荧光抗体 anti-CD4(PerCp-Cy5.5)、anti-IL17A(PE)、anti-Foxp3(AFP647)标记细胞后进行流式分析,以确定CD4+T细胞中Th17细胞和Treg细胞所占比例。分析FKBP51V55L突变和FKBP51-/-对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响。5.RT-PCR:通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测Th17细胞特异性转录因子RORyt、RORα、Stat3以及功能相关细胞因子IL17a、IL17f的mRNA水平。在mRNA水平上进一步验证FKBP51V55L和FKBP51-/-对CD4+T细胞向Th17细胞分化的影响。6.Western blot:通过Western blot检测Th17细胞分化特异性转录因子RORyt、细胞因子IL17、Th17细胞分化相关的AKT信号通路相关蛋白磷酸化和T细胞活化相关信号通路NF-κB、NFAT的相关蛋白的表达水平。探讨FKBP51对Th17细胞分化的作用机制。7.Luminex多因子检测:通过Luminex多因子检测试剂盒检测细胞培养上清液中 Th1、Th2、Th17 细胞分泌的细胞因子 IFN-γ、IL2、IL4、IL5、IL10、TNF-α、IL17A的含量。分析FKBP51V55L对Th17细胞功能的影响。结果:1.小鼠脾细胞CD4+T细胞的分离纯化:磁珠分选细胞的流式细胞术分析显示CD4+细胞比例大于97%,可以用于后续诱导Th17分化实验。2.FKBP51V55L突变促进CD4+T细胞向Th17细胞分化:体外CD4+T细胞在Th17诱导分化条件下培养5天后,流式细胞术分析发现,突变小鼠和野生小鼠Th17细胞比例分别为17.96±1.94%和8.36±0.73%,二组差异显著,(P<0.001);突变小鼠和野生小鼠Treg细胞比例分别为1.97±0.35%和2.87±0.33%,无明显差异,(p=0.087),提示FKBP51V55L突变促进Th17细胞分化。3.FKBP5ko促进CD4+T细胞向Th17细胞分化:体外CD4+T细胞在Th17诱导分化条件下培养5天后,流式细胞术分析发现,基因敲除小鼠和野生小鼠Th17细胞比例分别为7.33±0.72%和4.70±0.3 5%,二组差异有统计学意义,(P<0.05);基因敲除小鼠和野生小鼠Treg细胞比例分别为5.93±1.22%和4.67±2.27%,无明显差异,(p=0.649),提示FKBP51抑制TH17细胞分化。4.FKBP51V55L突变上调Th17细胞分化特异性转录因子和功能相关细胞因子的表达:V55L突变和野生小鼠CD4+T细胞在体外诱导分化5天后,western blot显示,突变小鼠Th17细胞特异性转录因子RORyt的蛋白表达水平明显高于野生小鼠(P<0.01);突变小鼠诱导细胞的IL17a和IL17fmRNA水平高于野生组(P<0.05),突变小鼠诱导细胞培养上清液中的IL17a浓度高于野生组(P<0.01),提示FKBP51V55L突变通过上调RORyt表达促进Th17细胞分化。5.FKBP5ko上调Th17细胞分化特异性转录因子RORyt和胞内IL17的蛋白水平:FKBP5基因敲除和野生小鼠CD4+T细胞在体外诱导分化5天后,western blot显示,FKBP5ko组RORγt的蛋白表达水平明显高于野生小鼠,(P<0.001);FKBP5ko组细胞胞内IL17a蛋白水平高于野生组(P<0.01),提示FKBP51通过下调RORyt表达抑制Th17细胞分化。6.AKT-mTOR信号通路参与FKBP51介导的Th17细胞分化:CD4+T细胞在体外Th17诱导分化条件下培养5天后,FKBP51V55L突变组AKTThr308位点的磷酸化水平高于野生组(P<0.05),mTOR蛋白水平均高于野生组(P<0.01),提示FKBP51V55L突变通过上调AKT T308磷酸化水平激活AKT/mTOR信号通路进而上调RORyt表达促进Th17分化。FKBP51基因敲除组AKT Thr308位点的磷酸化水平高于野生组(P<0.01),mTOR蛋白水平均高于野生组(P<0.01),提示FKBP51通过下调AKTT308磷酸化水平抑制AKT/mTOR信号通路进而下调RORyt表达抑制Th17分化。结论:FKBP51V55L突变通过激活AKT/mTOR信号通路上调Th17细胞特异性核转录因子RORyt的表达,促进Th17分化;FKBP51通过抑制AKT/mTOR信号通路降低Th17细胞特异性核转录因子RORyt的表达,抑制Th17分化。