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目的:构建特异性降低Elmo1真核基因表达的编码区的小发夹RNA重组质粒pSUPER.Retro.-GFP/neo-Elmo1i,并进行酶切电泳及测序列分析,检测其在卵巢癌细胞株SKOV3里对Elmo1基因表达的抑制效果,为进一步研究Elmo1与Dock180的相互作用,从而为探讨Elmo1在卵巢癌恶性生物学行为中的作用提供研究的基本工具。方法:应用酶学的方法,在体外将设计合成好的四条特异干扰目的基因(Elmo-mRNA)干扰序列(19 bp大小)分别与载体pSUPER.Retro. -GFP/neo(以下简称为pSR-GFP/neo)结合成四种具有自我复制能力的重组质粒pSR- GFP/neo-Elmo1i,进行酶切电泳及测定序列鉴定,分别转染至卵巢癌SKOV3细胞株,Western blot验证干扰后Elmo1蛋白表达量,筛选出抑制效率较高的两个质粒,继而通过转化细菌,筛选出含有目的基因的转化子细菌,进行扩增提取目的重组质粒,最后进行酶切电泳及测定序列鉴定。结果:构建特异干扰目的基因Elmo1的重组质粒4个,分别命名为pSR-GFP/neo-Elmo1i#1、-Elmo1i#2、-Elmo1i#3和-Elmo1i#4。根据重组质粒骨架上的酶切位点进行酶切电泳分析,以及DNA测序验证克隆成功。同时转染入SKOV3细胞中进行Western blot验证筛选出两个沉默效应最佳的Elmo1-shRNA。结论:特异性干扰Elmo1基因表达的小发夹RNA成功构建重组质粒,能有效抑制Elmo在卵巢癌细胞株表达,可以为我们进一步研究重组质粒对卵巢癌细胞株SKOV3中内源性Elmo1表达的影响,从而为探讨Elmo1对细胞运动及卵巢癌恶性浸润行为的作用打下基础。第二部分沉默Elmo1表达对Dock180表达水平及其对SKOV3细胞运动及浸润能的影响目的:利用卵巢癌细胞株SKOV3,构建Elmo1及Dock180表达下调的稳定克隆,并检测其对体外细胞增殖及浸润能的可能影响。方法:利用第一部分筛选出的2条特异针对靶基因Elmo1的小发夹RNA重组质粒pSR-GFP/neo-Elmo1i(pSR-GFP/neo-Elmo1i#3及-Elmo1i#4)转染SKOV3细胞,用G418筛选出稳定表达干扰序列的Elmo1-RNAi细胞株。通过与阴性对照组(空白质粒pSR-GFP/neo稳定转染对照组、阴性质粒pSR-GFP/neo-NT稳定转染对照组及未转染组即野生型WT),及课题前期构建的Dock180-RNAi稳定细胞株进行比较。利用WB验证转染效果的有效性及Elmo1/Dock180在细胞内表达水平的改变;Transwell小室侵袭实验、细胞生长曲线及平板克隆实验检测各个稳定转染株间细胞生物学特性的改变;GST-pull down检测二者的靶向效应酶Rac1活性改变。结果:利用两个重组质粒pSR-GFP/neo- Elmo1i#3和-Elmo1i#4成功构建出稳定表达Elmo1表达沉默的细胞株。我们观察到在Elmo1表达下调的细胞株内,其协同效应蛋白Dock180表达亦呈明显降低(P<0.05),同样,在Dock180表达受限的细胞内,Elmo1表达也呈低水平表达。与对照组相比,Elmo1-RNAi细胞与Dock180-RNAi细胞的Rac1小分子GTP酶活性均明显减弱,且两种细胞的体外细胞增殖、细胞动力、侵袭力均受到一定程度抑制(P<0.05)。结论:重组质粒pSR-GFP/neo- Elmo1i同时抑制了Elmo1及其协同效应分子Dock180蛋白在卵巢癌细胞内的表达,同样情况出现于干扰Dock180表达的细胞内,提示二者相互之间有着正向调控关系。Elmo1-RNAi和Dock180-RNAi细胞均表现出下游靶向效应酶Rac1活性减低,体外细胞增殖、细胞侵袭力受到明显抑制,提示二者通过相互支撑,协同刺激下游效应酶Rac1,调控细胞动力和卵巢癌细胞的恶性行为。