[背景与目的]据世界卫生组织(WHO)统计,截至2011年2月9日,全球累计报告H5N1型高致病性人禽流感病例520例,死亡307例,死亡率高达59.0%；国内报告H5N1型高致病性人禽流感病例40例,14例存活。目前虽然没有充分证据表明人与人之间可以相互传播,但H5N1禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)容易通过抗原漂移(antigen drift)或转移(antigen shift)发生变异,给H5N1禽流感疫苗的研发带来了极大挑战。如果出现禽流感病毒和人流感病毒基因重组株,并且新毒株获得人传人的能力,人类普遍对其缺乏有效免疫保护力,从而引发新的世界大流行。2006年我们通过使用恢复期血浆疗法成功治愈1例重症H5N1禽流感患者,从而开创了H5N1人禽流感被动免疫治疗的先河。人们在研究野生型H5N1禽流感病毒过程中,往往会面临危险性高、周期性长、试验条件苛刻等诸多难题,而假病毒(pseudotyped virus)技术的兴起为解决此类问题提供了一种非常有效的研究手段。因此,本研究首先通过分离深圳A/Shenzhen/406H/06病毒株,利用RT-PCR技术克隆HA、NA和NS基因,并对其基因特征、分子遗传进化特点进行深入分析；分别构建整合H5N1禽流感A/Shenzhen/406H/06和A/Thailand/KAN-1/04毒株HA、NA包膜蛋白的假型逆转录病毒,通过电镜、免疫印迹(Western-blot)技术对假病毒进行鉴定,建立基于假病毒技术的体外中和试验平台,为下一步人源单克隆中和抗体的筛选提供强有力的技术工具。[方法]1.将从深圳H5N1禽流感患者气管分泌物中分离的病毒液经0.22μm滤膜过滤后,感染10cm培养皿中4×106个MDCK细胞,48h后收集细胞上清液,以20%蔗糖垫底70000×g超速离心3h进行病毒浓缩,使用Trizol试剂提取病毒RNA。异丙醇沉淀RNA后溶于15μL无RNA酶的灭菌水中,紫外分光光度仪测其浓度(A260)及纯度(A260/A280)。2.根据A型流感病毒8个基因片段3’末端12个保守碱基序列设计反转录引物Uni12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’),取1μL病毒RNA在Uni12和AMV反转录酶的作用下合成AIV基因组c-DNA文库。设计3对针对HA、NA和NS基因的特异性引物。取2μL反转录产物并分别使用HA、NA与NS基因的引物进行扩增,3个基因片段的反应条件均为：94℃预变性2min,94℃变性30s,55℃退火45s,72。C延伸2min,循环30次,最后72。C延伸7min。PCR产物用1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳检测。3.使用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收PCR产物,在T4连接酶的作用下插入至pGEM-T Easy载体,连接产物直接用于转化JM109感受态细菌,通过蓝白斑筛选阳性克隆。将阳性克隆37。C过夜培养,小量抽提质粒并用Not I酶切鉴定,之后送Invitrogen公司测序鉴定。4.从GenBank中获取已公布的H5N1型HA、NA和NS基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列,应用Cluster及Mega3.1软件分析深圳人分离株H5N1 AIV的HA. NA和NS基因序列特征及同源性,并绘制其系统发育进化树。5.设计两端分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点扩增HA.NA基因的特异性引物,以pGEM-T-HA、pGEM-T-NA质粒作为模板进行PCR扩增,目的片段回收后使用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,随后与同样酶切的CMV/R质粒进行连接,转化E. coliJM109感受态细菌后挑取阳性克隆转化子。6.采用磷酸钙共沉淀法将pHR-Luc (14μg)、pCMV△8.2 (14μg). CMV/R-HA (2μg). CMV/R-NA (0.5μg)共4种质粒转染至293T细胞。由于VSV-G蛋白具有广谱的宿主范围,所以用pHR-Luc. pCMV△8.2和pVSV-G三种质粒共转染作为阳性对照,另外以pHR-Luc和pCMV△8.2两种质粒共转染作为阴性对照。转染48h后取细胞上清,-80。C冻存备用。7.将浓缩的H5N1禽流感假病毒粒子用含2%戊二醛的PBS进行固定,然后吸附在洁净的铜网中,2%磷钨酸钠(pH=6.5)进行负染色以进行电镜观察。同时取浓缩后的假病毒,按照文献介绍的Western-blot方法分析HA及P24的表达。其中HA一抗为H5N1 AIV灭活株免疫鼠血清(1：1000稀释),P24一抗为鼠抗P24多克隆抗体(1：1000稀释)。两种蛋白的二抗均为碱性磷酸酶标记兔抗鼠IgG(1:3000稀释)。8.假病毒感染前24h在24孔板上分别接种2×104个MDCK细胞,分别以1000μL. 200μL、40μL三个梯度的假病毒上清感染靶细胞,每个梯度设立3个复孔,并加入Polybrene(终浓度为8μg/mL)促进病毒粒子吸附,感染48h后按照检测感染细胞株中报告基因Luciferase的相对活性(relative luciferase activity, RLA),从而间接判断假病毒的感染活性。9.将MDCK细胞接种于24孔板,37℃,5%CO2培养过夜。使用PBS将每份恢复期血清从1：10开始进行2倍梯度稀释,共12个梯度,然后分别按血清和病毒1：1的体积比与200μL深圳株(或泰国株)假病毒混合,并以与40μL VSV-G假病毒作为阴性对照,37。C孵育2 h,然后将混合物加入到MDCK细胞中,37℃吸附2h后吸弃混合物,继续培养48h后测定RLA。以无血清阻断的细胞孔的RLA作为空白对照值,按照以下公式计算血清对假病毒的感染抑制率：[结果]1.H5N1 AIV的RNA提取及其HA、NA和NS基因RT-PCR扩增：从H5N1AIV中提取的RNA经紫外分光光度仪测定A260为122.3μg/mL, A260/A280为1.82,表明RNA的浓度及纯度符合需求。以RNA为模板采用两步法RT-PCR扩增以上3个基因片段,经1%(W/V)琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段大小分别约为1.7kb、1.4kb和800bp,与预期大小相符。2.AIV的HA. NA和NS基因克隆与鉴定：PCR产物纯化后按照常规方法与pGEM-T Easy载体进行连接、转化,用NotⅠ(目的片段克隆位点两侧均有NotⅠ酶切位点)酶切鉴定,结果分别出现与pGEM-T Easy载体(3.0kb)和预期扩增的片段大小相等的条带。将该病毒株3个基因片段的重组质粒送Invitrogen公司测序鉴定,毒株命名为A/Shenzhen/406H/06,并已经登录至GenBank, HA、NA. NS基因的编号分别为EF137706、EF137708. EF137710。3. H5N1 AIV的HA、NA、NS基因序列特征：HA基因编码567aa, HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为SPLRERRRKR↓GLF。与其它病毒株HA蛋白序列相比较,该毒株在受体结合位点Tyr91、Trp149、Ile151、His179、Asn182、Leu190、Gln192以及130～134 (GVSSA)和220～224 (NGQSG)等位点相当保守。HA蛋白中保留了传统的7个糖基化位点,另外出现Ala156Thr突变,从而在Asn154增加了一个潜在糖基化位点。NA基因编码449aa,其一级结构包括氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和头部共4个结构域。与H1N1 AIV进行比对,发现A/Shenzhen/406H/06在49～68位缺失20个氨基酸,从而导致NA茎部丢失4个潜在糖基化位点(NQS、NNT、NQT、NIS)。NS基因含有2个开放读码框,编码NS1和NS2蛋白。NS1由225aa组成,与A/Hongkong/156/97进行比对发现在80～84位发生氨基酸缺失。4. H5N1 AIV的HA、NA、NS基因系统进化树的绘制：依据HA基因AIV可分为两大谱系：北美谱系与欧亚谱系,其中欧亚谱系大致分为4个分枝,即中国内地分枝、青海分枝、02/03香港分枝和97香港分枝。A/Shenzhen/406H/06位于欧亚谱系中国内地分枝上。NA基因分为三大谱系,即经典猪源谱系、人源谱系、禽源谱系。A/Shenzhen/406H/06属于禽源谱系。NS基因可分为等位基因A群和B群。A/Shenzhen/406H/06属于等位基因B群,与A/Dk/Fujian/1734/05和A/Dk/Hunan/191/05处于同一进化分枝上,其核苷酸同源性分别为98.3%和94.8%。5. CMV/R-HA、CMV/R-NA表达载体的构建及鉴定：以pGEM-T-HA、NA载体为模板进行PCR扩增,同时在扩增片段两端分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点,扩增片段大小与预期大小相符。扩增片段与CMV/R载体连接后,经过酶切鉴定产生与CMV/R空载体(4.0Kb)和目的片段大小一致的条带,从而证明HA、NA基因成功克隆至CMV/R载体。6.H5N1禽流感假病毒的电镜观察：由于假病毒系统是由慢病毒载体构建而来,其衣壳蛋白来源于HIV-1的gag,而包膜蛋白则由HA、NA代替gp120,因此其病毒粒子直径应该与HIV-1相近,约100nm。另外假病毒粒子分布于病毒出芽、释放等各个阶段,与野生型病毒的生活周期非常相似。7.H5N1禽流感假病毒HA、P24蛋白Western-blot鉴定：将裂解后的假病毒用H5N1 AIV灭活株免疫鼠血清进行孵育,在深圳株、泰国株假病毒泳道中出现3条条带,白上而下分子量约为80×103、55×103和25×103,分别与HA前体蛋白HA0、HA0裂解后形成的HA1和HA2蛋白大小相符,提示假病毒表面整合了H5N1 AIV HA蛋白,而对于仅转染pHR-Luc和pCMVA8.2两种质粒的阴性对照则未出现HA条带。而将裂解病毒与鼠抗P24多克隆抗体分别进行孵育,则深圳株、泰国株假病毒以及阴性对照均出现P55、P41和P24共3条条带,提示三种细胞上清中均存在HIV病毒样粒子(virus-like particle, VLP)。8.H5N1禽流感假病毒的感染活性：深圳株、泰国株假病毒均具有感染活性,效价略低于作为阳性对照的整合VSV-G蛋白的假病毒,200μL假病毒上清感染MDCK细胞后RLA值约为2×104,明显高于仅转染pHR-Luc和pCMVA8.2两种质粒的阴性对照(未整合HA、NA蛋白的HIV病毒样粒子)。9.基于假病毒技术体外中和试验平台的建立：将12个梯度稀释的深圳和安徽血清分别与深圳株、泰国株假病毒进行中和反应,并以VSV-G假病毒作为阴性对照,深圳恢复期血清对自身分离的深圳株假病毒RLA值的50%抑制浓度(IC50)约为1：10240,而对泰国株假病毒中和效价显著低于深圳株,IC50介于1：160～320,而对VSV-G假病毒基本无中和能力。安徽恢复期血清对深圳株假病毒的中和效价高于泰国株,其中对深圳株假病毒的IC50介于1：5120～10240,低于深圳患者自身恢复期血清的中和能力(1：10240)；而对泰国株假病毒的IC50介于1：2650～5120,则显著高于深圳恢复期血清。[结论]1. A/Shenzhen/406H/06 HA蛋白裂解位点含有多个连续的碱性氨基酸,具备高致病性毒株的基因特征,另外Ala156Thr突变导致在Asn154增加一个潜在糖基化位点,可能是影响AIV毒力的另一重要因素。NA蛋白茎部缺失49～68aa可以导致H5N1 AIV的毒力下降,NS1蛋白80～84aa缺失可导致H5N1 AIV抗干扰素能力下降,但HA 156位新增的潜在糖基化位点将弥补以上缺失所致的负面作用,从而使其复制、增殖、致病性及传播力不受影响。2.深圳虽然在地理位置上毗邻香港,但A/Shenzhen/406H/06与97/02/03香港分离株处于不同进化分枝,表明A/Shenzhen/406H/06并非起源于香港,再者虽然A/Shenzhen/406H/06与东南亚分离株共同属于同一谱系,但在谱系内部所属分枝不同,遗传进化距离较远,另外与05年青海湖分离株亲缘关系也较远。相反,A/Shenzhen/406H/06与中国内地流行株(如A/Anhui/1/05、A/Dk/Fujian/1734/05等)具有很高的同源性,提示它们可能来源于同一祖代毒株。3.利用慢病毒载体系统成功构建整合H5N1 AIV HA、NA包膜蛋白的假型逆转录病毒,其内在衣壳蛋白为HIV-1 gag蛋白,包膜蛋白来源于H5N1 AIV,属于嵌和病毒。假病毒仅具有单轮感染活力,安全性好,在细胞嗜性、吸附过程及出芽过程与真病毒相似,并且携带有报告基因,可以快速方便的进行各种检测和分析。4. H5N1 AIV天然诱导人体的血清对不同分枝毒株均具有中和活性,但中和效价存在一定差异,其中针对深圳株假病毒,深圳血清中和能力强于安徽血清,而对于泰国株假病毒,安徽血清的中和效价则明显高于深圳血清。提示subclade2.3毒株诱导的血清对多种毒株具有交叉反应性,进而有望从外周血中开发出针对多种分枝H5N1AIV的广谱中和抗体。