研究目的:本课题旨在探讨CD24分子在小鼠急性肝损伤过程中对NKT细胞的影响,包括数量,刺激活化及细胞因子分泌水平的改变。研究内容包括三部分:一、检测正常生理状态下,野生型小鼠（WT小鼠）和CD24基因敲除小鼠(CD24^-/-小鼠)的肝脏NKT细胞数量;二、建立刀豆蛋白A（Concanavalin A,Con A）小鼠急性肝损伤模型,观察WT和CD24^-/-小鼠的肝脏损伤程度及肝内NKT细胞的变化;三、建立α-GalCer（α-Galactosylceramide）模型,特异性活化NKT细胞,观察WT和CD24^-/-小鼠的肝脏炎症程度和肝脏NKT细胞的数量和活化程度的差异,验证CD24分子通过NKT细胞调节小鼠急性肝损伤。研究方法与结果:本实验课题分三部分进行:第一部分正常生理状态下,CD24分子对小鼠肝内NKT细胞的调节作用,主要包括两方面的实验:1.CD24基因敲除小鼠的鉴定应用流式细胞术,通过眼内眦静脉取血检测血细胞或检测小鼠脾细胞的表面CD24分子的表达进行鉴定。结果表明:CD24基因敲除小鼠中CD24未检出,说明基因敲除小鼠构建和繁育正常。2.正常生理状态下,CD24分子对小鼠肝内NKT细胞的调节应用流式细胞术测定正常生理状态下,WT和CD24^-/-小鼠肝内NKT细胞的数量变化。结果表明,CD24基因敲除后,小鼠肝内NKT细胞显著减少,提示CD24分子可能对肝内NKT细胞的数量有一定的调控作用。第二部分观察Con A诱导小鼠急性肝损伤中,WT和CD24^-/-小鼠肝脏炎症程度及肝内NKT细胞的数量及活性变化:1.建立Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型,观察CD24分子对小鼠急性肝损伤的调节作用分别给WT小鼠和CD24^-/-小鼠尾静脉注射Con A（10mg/kg）,8¹0h后,检测小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）水平,以及肝组织石蜡切片HE染色,观察小鼠急性肝损伤状况。结果显示,Con A注射后,实验组小鼠出现严重急性肝损伤,CD24^-/-小鼠的肝脏损伤程度及炎症状态显著高于WT鼠,说明CD24分子在Con A诱导的急性肝损伤中起抑制炎症反应的作用。2.CD24分子在Con A诱导急性肝损伤过程中,对小鼠肝内NKT细胞的调节作用（1）CD24分子在小鼠急性肝损伤过程中对肝内NKT细胞数量的调节作用流式细胞术检测Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型中NKT细胞的变化,比较四组小鼠中肝脏NKT细胞总量及细胞亚型（NKT1、NKT2、NKT17）的改变。结果表明,Con A诱导的急性肝损伤模型中NKT细胞数量显著升高,其中NKT1所占比例最高,变化也最显著,进一步分析发现CD24^-/-小鼠的肝内NKT总量以及NKT1的数量都高于WT组,NKT2则降低,但两种基因型小鼠之间无明显差距,NKT17显著降低。用小鼠单克隆抗体Anti-CD1d:α-GalCer Dimer对肝组织切片进行免疫荧光染色,直接检测肝组织NKT细胞的数量变化。结果表明,Con A注射后,肝内NKT细胞数量升高,CD24^-/-小鼠显著高于WT鼠。（2）CD24分子在小鼠急性肝损伤过程中对肝内NKT细胞活性的调节作用流式细胞术检测NKT细胞胞内因子的分泌水平（IFN-γ,IL-4）及活化情况（CD69）;Real-time PCR检测Con A急性肝损伤模型中,小鼠肝脏组织促炎性细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-4和转录因子PLZF（zbtb16）mRNA的表达量变化。结果表明,Con A诱导小鼠急性肝损伤模型中,CD24^-/-小鼠肝组织TNF-α,IFN-γ,IL-4及PLZF mRNA表达水平更高。第三部分应用α-GalCer特异性活化NKT细胞,进一步观察CD24分子通过NKT细胞调节小鼠急性肝脏炎症和损伤过程:1.CD24分子对α-GalCer诱导的小鼠急性肝损伤的调节作用小鼠腹腔注射α-GalCer（2μg/只,12h）,肝组织石蜡切片H&E染色,对比WT和CD24^-/-小鼠的肝脏炎症变化,测定小鼠血清ALT水平,进一步确定小鼠肝脏炎症程度。结果表明,CD24^-/-小鼠注射α-GalCer后,肝脏淋巴细胞浸润比WT少,血清ALT值低,说明CD24基因敲除后,小鼠肝脏炎症程度低于WT小鼠。2.α-GalCer模型中,CD24分子对肝内NKT细胞的调节作用（1）CD24分子对肝内NKT细胞数量的调节作用流式细胞术检测α-GalCer活化NKT细胞后,对比WT和CD24^-/-小鼠中,肝脏NKT细胞总量及亚型（NKT1,NKT2,NKT17）的差异。结果表明,α-GalCer注射后,小鼠肝内NKT细胞数量显著增多,其中NKT1所占比例最高,变化最显著。但不论正常生理状态还是活化后,CD24^-/-小鼠肝内NKT总量以及NKT1和NKT2的数量都低于WT组,NKT17变化不明显。用荧光标记的小鼠单克隆抗体Anti-CD1d:α-Gal Cer Dimer对肝组织石蜡切片进行免疫荧光染色,直接观察肝组织中NKT细胞的数量变化。结果表明,正常生理状态及α-GalCer模型中,CD24^-/-小鼠肝内NKT细胞数量均显著低于WT鼠。（2）CD24分子对肝内NKT细胞活性的调节作用流式细胞术检测NKT细胞胞内因子的分泌水平（IFN-γ,IL-4）及活化情况（CD69）;Real-time PCR检测α-Gal Cer急性肝损伤模型中,小鼠肝脏组织水平细胞因子mRNA的表达量变化,包括TNF-α,IFN-γ,IL-4及PLZF（zbtb16）。结果表明,α-GalCer注射后,小鼠肝组织中TNF-α,IFN-γ,IL-4及PLZF的基因表达水平均升高,但CD24^-/-小鼠显著低于WT鼠。结论:1.CD24^-/-小鼠基因鉴定结果正确;正常生理状态下,CD24分子敲除后,小鼠肝内NKT细胞显著降低。2.Con A诱导的小鼠急性肝损伤模型中,CD24^-/-小鼠肝脏炎症及损伤程度,肝内NKT细胞数量（尤其是NKT1）、NKT细胞的活性以及肝脏组织的炎性因子（TNF-α,IFN-γ,IL-4）和转录因子（PLZF）的表达量均显著高于WT鼠。3.α-GalCer活化NKT细胞小鼠炎症模型中,CD24^-/-小鼠各项结果与Con A模型不同,即肝脏炎症及损伤程度,肝内NKT细胞及各亚型的数量、NKT细胞活性以及肝脏组织的炎性因子和NKT细胞特异性转录因子的表达水平均显著低于WT小鼠。4.CD24分子通过NKT细胞调节小鼠急性肝损伤过程和对NKT细胞本身发育和活性的调控,可能是通过两个不同的分子机制实现的。