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目的:通过观察JAK-STAT通路抑制剂AG490对IGF-1调控人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)增殖、矿化能力及矿化相关基因的影响,探讨JAK-STAT通路在IGF-1促牙髓细胞增殖和分化中的作用。方法:牙髓细胞分离培养及来源鉴定:选取因阻生或者正畸减数拔除的健康恒牙,采用组织块酶消化法分离、提取牙髓细胞并进行原代培养,当细胞增殖并汇合达孔底80%时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代,牙髓细胞传至3~4代时,选用免疫组化法检测波形蛋白和角蛋白表达以鉴定细胞来源。IGF-1对人牙髓细胞增殖的影响:以3×103个/孔牙髓细胞接种于96孔培养板中,细胞培养24h后,换无血清DMEM饥饿细胞24h,然后分别用含2%血清浓度的5、10、25、50和100ng/ml IGF-1刺激液继续培养,培养1d、3d、5d和7d,每3天换一次液,每孔加20μl MTT溶液,4h后吸净培养液,每孔加150μl DMSO溶液,酶标仪以490nm波长检测各孔吸光度(OD)值。IGF-1诱导牙髓细胞增殖过程中JAK-STAT通路的作用:以同样实验条件将牙髓细胞接种于96孔板中,分5组:①对照组②空白对照组③100ng/ml IGF-1组④50μmol/L AG490+100ng/ml IGF-1组⑤50μmol/L AG490组,培养1d、3d、5d和7d采用MTT法检测细胞增殖。碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析IGF-1对人牙髓细胞的矿化作用:以2×105个/孔牙髓细胞接种于6孔板中,待牙髓细胞融合至80%时,换成以下4组矿化诱导液①矿化诱导液(Control/M)②100ng/ml IGF-1的矿化诱导液③100ng/ml IGF-1+50μmol/L AG490的矿化诱导液④50μmol/L AG490的矿化诱导液,分别刺激牙髓细胞7d、14d和21d,在室温下用4%的多聚甲醛固定30min,分别进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色分析。茜素红染色后每孔加入1ml10%氯化十六烷基吡啶,测定562nm波长下OD值。RT-PCR检测成牙/成骨基因m RNA的表达:在上述4组矿化诱导14d的牙髓细胞中加入1ml TRIzol,参考TRIzol说明书提取总RNA。根据M-MLV第一链合成系统操作说明书反转录获得单链c DNA,使用RT-PCR检测ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表达。Western blot及免疫荧光法检测JAK-STAT通路JAK2蛋白磷酸化水平:用含蛋白磷酸酶抑制剂的细胞裂解液RIPA将上述4组矿化诱导4h后的牙髓细胞裂解,提取总蛋白,采用SDS-PAGE凝胶电泳,随后转至PVDF膜,牛奶蛋白封闭后,分别孵育p-JAK2(1:1000)与GAPDH(1:1000)一抗及抗兔Ig G二抗(1:20000),最后用双色红外激光扫描仪进行扫膜,Image J软件分析结果。将处于对数生长期的牙髓细胞消化,以104个/ml浓度的细胞悬液接种于六孔板中,培养24h后,更换为上述4组矿化诱导液,继续培养4h,用4%多聚甲醛固定细胞30min,随后用山羊血清封闭30min,再分别孵育兔抗p-JAK2一抗(1:100)与抗兔Ig G二抗(1:1000),最后加入DAPI将细胞核蓝染,立刻在免疫荧光显微镜下观察。用SPSS 13.0统计软件,数据结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析及S-N-K法进行统计学分析,P<0.05为有统计学意义。结果:1在体外成功分离和培养出人牙髓细胞,免疫组化法鉴定细胞证实牙髓细胞为中胚层间充质细胞来源。2通过MTT法检测IGF-1不同浓度(5~100ng/ml)对牙髓细胞增殖的影响,结果为牙髓细胞培养至第5d和7d时,25、50、100ng/ml IGF-1组增殖均高于对照组(P<0.05),并随浓度升高,细胞增殖越多,100ng/ml IGF-1组细胞增殖显著(P<0.01)。本实验发现IGF-1+AG490组可以明显抑制牙髓细胞的增殖作用(P<0.01)。3 IGF-1组7d、14d及21d形成的矿化结节含量及ALP染色均明显多于Control/M组,而IGF-1+AG490组矿化结节形成量较IGF-1组少,差异均有统计学意义(P<0.05)。4 RT-PCR检测4组矿化诱导液培养14d的人牙髓细胞,发现IGF-1组中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA表达升高,且差异显著(P<0.05),IGF-1+AG490组中ALP、OCN、OPN和DSPP的m RNA水平明显低于IGF-1组(P<0.05),与茜素红及ALP染色结果一致。5矿化诱导液诱导牙髓细胞4h后,通过Western blot及免疫荧光染色检测JAK-STAT通路中JAK2蛋白磷酸化水平,结果显示IGF-1组磷酸化JAK2(p-JAK2)蛋白表达高于对照组,而IGF-1+AG490组明显低于IGF-1组(P<0.05)。结论:1采用组织块酶消化法,在体外成功培养出大量人牙髓细胞,并经免疫组化鉴定其来源于中胚间充质干细胞,第3~4代牙髓细胞增殖能力强、细胞形态良好,符合后续实验要求。2 25~100ng/ml IGF-1可以促进牙髓细胞的增殖,具有浓度依赖性,100ng/ml IGF-1是促进牙髓细胞增殖和矿化的最佳浓度。3 IGF-1作用于牙髓细胞使JAK2蛋白磷酸化水平升高,IGF-1可能通过JAK-STAT信号通路促进牙髓细胞的增殖和分化,同时可以提高成骨分化蛋白ALP、OCN、OPN和成牙本质分化蛋白DSPP基因的m RNA表达。