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目的:本研究旨在证明肌营养不良蛋白聚糖DG是否与Sedlin蛋白之间存在相互作用,以及进一步探寻DG中与Sedlin存在相互作用的具体结构域。并依次应用了质粒构建、酵母双杂交、免疫印迹、GST Pulldown、间接免疫荧光以及免疫共沉淀等实验技术,分别从酵母细胞、哺乳动物细胞以及体外三个层面对此加以证实,为探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的细胞学基础。 方法:在酵母双杂交实验中,我们依次构建DG的酵母表达质粒pGΑDT7-DAG1,pGBKT7-DΑG1,并分别与本实验室保存的Sedlin的酵母表达质粒pGBKT7-SEDL,pGΑDT7-SEDL共同转化至酵母细胞(ΑH109)中,然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选,并对生长出的克隆进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定,通过观察克隆是否变蓝来证明 DG是否与 Sedlin存在相互作用。然后我们继续构建pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表达质粒。在GST Pulldown实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG单独转染到哺乳动物细胞(HEK293T),然后提取细胞总蛋白,与本实验室保存的GST-Sedlin融合蛋白在体外混悬,收集谷胱甘肽珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。在间接免疫荧光实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(COS7),进行免疫荧光制片,通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察DG是否与Sedlin存在共定位现象。在免疫共沉淀实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(HEK293T),提取细胞总蛋白,利用FLAG抗体孵育和琼脂糖珠沉淀后,收集珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。接下来,我们又利用了上述同样的实验方法,进一步研究了 DG的两个结构域(α-DG和β-DG)与Sedlin之间的相互作用情况。 结果:酶切鉴定结果和测序结果一致证明所需质粒构建成功。酵母双杂交实验显示,共同表达了DG和Sedlin两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中能够正常生长,且克隆在进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定后颜色变蓝,即证明二者存在相互作用。GST Pulldown实验显示,当用FLAG抗体免疫印迹后,实验组(GST-Sedlin+DG-FLΑG)能够检测到DG的存在,表明GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下能够下拉 DG蛋白,则证明二者存在相互作用。间接免疫荧光实验显示,DG在COS7细胞主要分布在细胞质中,而Sedlin在细胞质和细胞核中都有分布,且二者在细胞质中存在明显的共定位现象。免疫共沉淀实验显示,当用GFP抗体免疫印迹后,实验组(Sedlin-GFP+DG-FLΑG)中能够检测到Sedlin-GFP的存在,表明FLAG抗体在沉淀DG-FLΑG的同时也将Sedlin-GFP共同沉淀下来,即证明二者存在相互作用。在进一步的研究中,GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下也能下拉α-DG和β-DG蛋白;且α-DG和β-DG与Sedlin在COS7的细胞质中也都存在共定位现象;且FLAG抗体在沉淀α-DG和β-DG的同时也能将Sedlin共沉淀下来,这一致表明α-DG和β-DG都与Sedlin存在相互作用。 结论:通过酵母双杂交、GST下拉技术、间接免疫荧光、免疫共沉淀等四种技术充分证实了肌营养不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母细胞中、哺乳动物细胞中以及体外实验中都存在相互作用,且DG的两个结构域,即α-DG和β-DG都能与Sedlin蛋白存在相互作用,为进一步研究它们之间的关系奠定了基础。