肌营养不良蛋白聚糖DG与Sedlin蛋白的相互作用

来源 :安徽医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kateyg2919
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的:本研究旨在证明肌营养不良蛋白聚糖DG是否与Sedlin蛋白之间存在相互作用,以及进一步探寻DG中与Sedlin存在相互作用的具体结构域。并依次应用了质粒构建、酵母双杂交、免疫印迹、GST Pulldown、间接免疫荧光以及免疫共沉淀等实验技术,分别从酵母细胞、哺乳动物细胞以及体外三个层面对此加以证实,为探索DG蛋白和Sedlin蛋白的功能奠定一定的细胞学基础。  方法:在酵母双杂交实验中,我们依次构建DG的酵母表达质粒pGΑDT7-DAG1,pGBKT7-DΑG1,并分别与本实验室保存的Sedlin的酵母表达质粒pGBKT7-SEDL,pGΑDT7-SEDL共同转化至酵母细胞(ΑH109)中,然后在SD3-(-Leu/-His/-Trp)培养基上进行营养筛选,并对生长出的克隆进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定,通过观察克隆是否变蓝来证明 DG是否与 Sedlin存在相互作用。然后我们继续构建pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG真核表达质粒。在GST Pulldown实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG单独转染到哺乳动物细胞(HEK293T),然后提取细胞总蛋白,与本实验室保存的GST-Sedlin融合蛋白在体外混悬,收集谷胱甘肽珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。在间接免疫荧光实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(COS7),进行免疫荧光制片,通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察DG是否与Sedlin存在共定位现象。在免疫共沉淀实验中,将pcDNΑ3.1-DΑG1-FLΑG和pcDGFP-SEDL共同转染到哺乳动物细胞中(HEK293T),提取细胞总蛋白,利用FLAG抗体孵育和琼脂糖珠沉淀后,收集珠子进行免疫印迹分析证明DG是否与Sedlin存在相互作用。接下来,我们又利用了上述同样的实验方法,进一步研究了 DG的两个结构域(α-DG和β-DG)与Sedlin之间的相互作用情况。  结果:酶切鉴定结果和测序结果一致证明所需质粒构建成功。酵母双杂交实验显示,共同表达了DG和Sedlin两种蛋白的酵母细胞在SD3-培养基中能够正常生长,且克隆在进行α-半乳糖苷酶(X-α-gαl)活性测定后颜色变蓝,即证明二者存在相互作用。GST Pulldown实验显示,当用FLAG抗体免疫印迹后,实验组(GST-Sedlin+DG-FLΑG)能够检测到DG的存在,表明GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下能够下拉 DG蛋白,则证明二者存在相互作用。间接免疫荧光实验显示,DG在COS7细胞主要分布在细胞质中,而Sedlin在细胞质和细胞核中都有分布,且二者在细胞质中存在明显的共定位现象。免疫共沉淀实验显示,当用GFP抗体免疫印迹后,实验组(Sedlin-GFP+DG-FLΑG)中能够检测到Sedlin-GFP的存在,表明FLAG抗体在沉淀DG-FLΑG的同时也将Sedlin-GFP共同沉淀下来,即证明二者存在相互作用。在进一步的研究中,GST-Sedlin融合蛋白在体外条件下也能下拉α-DG和β-DG蛋白;且α-DG和β-DG与Sedlin在COS7的细胞质中也都存在共定位现象;且FLAG抗体在沉淀α-DG和β-DG的同时也能将Sedlin共沉淀下来,这一致表明α-DG和β-DG都与Sedlin存在相互作用。  结论:通过酵母双杂交、GST下拉技术、间接免疫荧光、免疫共沉淀等四种技术充分证实了肌营养不良蛋白聚糖DG和Sedlin蛋白在酵母细胞中、哺乳动物细胞中以及体外实验中都存在相互作用,且DG的两个结构域,即α-DG和β-DG都能与Sedlin蛋白存在相互作用,为进一步研究它们之间的关系奠定了基础。
其他文献
根据农业农村部《2019年渔业渔政工作要点》要求:落实养殖水域滩涂规划编制和发布,推进规划全覆盖,依法依规开展水域滩涂规划养殖登记发证,广西农业农村厅着力抓好全区设区市
期刊
高光谱遥感使得遥感影像和光谱合一,实现了人类认识论中的逻辑思维和形象思维的统一,大大提高了人类对客观世界的认知能力。成像光谱仪(imaging spectrometer)能够得到上百波
贵港市77.05%的土壤为富硒土壤,是目前我国富硒土壤含量较高、最连片、最具有开发富硒农产品的优质地区之一近年来,贵港市委、市政府高度重视富硒产业发展和产品品牌培育工作,
期刊
本实验以角毛壳菌(Chaetomium cupreum)及其抗药性基因转化子C1、C2为实验材料,对角毛壳菌(C. cupreum)抗药性基因转化子从生理特性、培养特性、生物防治特性、产细胞壁降解
贺州市牢牢把握建设广西东融先行示范区这一难得的机遇,坚持以粤港澳大湾区市场需求为导向,以企业为龙头、基地为依托、市场需求为导向,全力打造直供粤港澳大湾区高品质蔬菜
期刊
2019年4月19日,在广东江门举行的全国现代农业产业园工作推进会上,来宾市国家现代农业产业园作为首批认定的20个国家级产业园,获得正式授牌,来宾成为广西首个获得这一国字号
期刊
百色市因地制宜发展特色扶贫产业,重点打造以果(芒果)、蔬、蔗、粮为主的右江河谷无公害农业产区,以烟、桑、果(柑橙)、油(山茶油)、药(中药材)为主的南部山区绿色农业产区,
期刊
双能减影成像(Dual-energy Subtraction Imaging)通过将样品在元素高低能段的两幅图像进行能量相减处理,消除不必要的背景,从而增强元素分布部位的信息。因此,被广泛应用于医
2019年以来,玉林市以环境秀美生活甜美乡村和美三个专项行动为主攻方向,推进乡村振兴战略向纵深拓展提升.如今在玉林的广大乡村,人居环境明显改善,村容村貌显著提升,人民群众
期刊